基于草甘膦抗性基因的大豆转基因体系的建立与验证

基于草甘膦抗性基因的大豆转基因体系的建立与验证

大豆是重要的粮食和油食动物，也是人类主要的食物原因和资源来源。自1996年美国孟山都公司开发的抗草甘娜转换率大豆被批准用于商业目的以来，世界转换率大豆的种植面积逐年增加，占总种植面积的81%。中国是世界上最大的大豆出口国。由于低生产效率和年产量的下降，目前的全球大豆产量占总进口量的80%。建立中国的独立汇率控制体系对恢复中国的大豆生产和提高大豆行业的国际竞争力具有重要意义。根癌农杆菌介导的植物转基因法具有成本低、转化植株的外源基因拷贝数较少、后代遗传更稳定等优势,是大豆转基因的主要手段.与其他物种相比,大豆是一种再生困难的作物,转基因效率普遍较低.研究表明,农杆菌与植物细胞间的相互作用是影响大豆转基因效率的关键因素[7~9],而受体基因型、外植体活力、农杆菌菌株、载体、筛选系统(包括筛选剂类型以及筛选压力)、激素配比、抗氧化剂、温度、光等因素,也会影响大豆转化效率.草甘膦是一种有机磷除草剂,它的生物活性很高,具有高效、低毒、杀草谱广、易分解、低残留、对环境影响相对较低等特点,是农业上应用最为广泛的一种除草剂.植物体中有3种芳香族必需氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸),它们的生物合成途径中有一个关键性酶—5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyryvylshikimicacid-3-phosphatechorismatesynthase,EPSPS),它能催化莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)合成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimmateacid-3-phosphate,EPSP).草甘膦是PEP的一种结构类似物,能够与EPSPS蛋白结合位点结合,从而竞争性抑制该酶的活性,阻断了植物莽草酸途径,导致苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族必需氨基酸的生物合成受阻,从而使莽草酸过度积累而影响植物正常生长,最终导致死亡[12~14].从抗高浓度草甘膦的微生物中分离获得的草甘膦不敏感EPSPS蛋白编码基因,是抗草甘膦转基因作物的基因源.例如,商业化生产的抗除草剂转基因大豆中采用CP4-EPSPS基因,是从农杆菌菌株CP4中分离获得,CP4-EPSPS蛋白对草甘膦的亲和力非常低,导入大豆及其他农作物后其酶活性不被草甘膦抑制,从而使转基因植物高抗草甘膦.大豆转基因体系中常用的筛选剂包括潮霉素(hygromycin)和草胺膦(glufosinate).通过对大豆转基因体系的摸索和完善,本实验室以草胺膦为筛选标记的大豆转化体系效率已经达到4.59%以上.在培育抗草甘膦转基因大豆过程中,一方面出于产品的安全性考虑,转基因过程中要求尽可能地避免使用选择标记基因;另一方面,转基因过程中直接用目的性状进行筛选可获得性状突出的转基因事件.因此,抗除草剂转基因大豆的培育中理想的转基因体系应以除草剂作为直接筛选物.通过对EPSPS基因及转基因体系的优化,建立了一个以草甘膦为直接筛选剂的大豆遗传转化体系,并获得了一批稳定遗传的转基因后代.本研究结果对国内抗草甘膦转基因大豆转基因方法研究及抗除草剂新品种选育具有重要意义.1材料和方法1.1植物材料实验用的大豆品种为天隆1号、华春3号、威廉姆斯82和杰克.1.2实验用培养基实验用的双元载体为pSOY11,pSOY12和pSOY19.这些载体的T-DNA区段由高抗草甘膦的假单胞杆菌中分离的目的基因G6-EPSPS(EU169459.1)和G10-EPSPS(AAF10666.1)组成(图1).双元载体pSOY11和pSOY19的骨架是pCAMBIA1300载体,通过XhoⅠ酶切将原载体中潮霉素抗性基因hpt切除,加入来自于苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus)的增强子序列和棉花(GossypiumhirsutumL.)EPSPS基因前246个碱基的叶绿体信号肽(图1).pSOY12的T-DNA区域除了G6基因表达框外,还携带了bar基因的表达框,转基因过程中可选用草胺膦作为筛选剂.实验用的根癌农杆菌菌株为LBA4404.在pSOY19载体的基础上构建了双元载体pSOY17,pnBT,pnsBT,pGMⅠ,pGMⅡ和pGMⅢ,这些载体除了筛选标记基因外,还分别携带了抗虫(pnBT,pnsBT)和高产(pGMⅠ,pGMⅡ,pGMⅢ)等目的基因或报告基因(pSOY17携带GUS).以这些载体开展的转基因研究数据也体现在本研究中.实验用农杆菌首先在加有相应抗生素的YEP(yeastextract-peptone)液体培养基(10g/L蛋白胨,10g/L酵母浸膏,5g/L氯化钠,pH7.0)中振荡培养至饱和,培养温度为28℃,振荡速率为250r/min.饱和菌液用250mLYEP液体培养基扩大培养至A650nm=0.8~1.0,2000×g离心10min收集菌落后,用液体共培养基(liquidco-cultivationmedium,LCCM)重悬沉淀后备用.LCCM培养液含1/10的B5大量元素、B5微量元素和维生素、3%蔗糖、有机缓冲剂2(N-吗啉)乙醇磺酸3.9g/L,pH5.4,120℃灭菌20min.在无菌环境下加入赤霉素(gibberellicacid,GA3)0.25mg/L、6-苄基腺嘌呤(benzylaminopurine,BAP)1.67mg/L、半胱氨酸(Cys)400mg/L、二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)154.2mg/L、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)200μmol/L.1.3大豆种子吸胀改性co-cutivationmof2转化方法参考美国IowaStateUniversity,PlantTransformationFacility使用的农杆菌介导的大豆子叶节转化法.大豆种子采用氯气干法灭菌16h后播种到萌发培养基上(蔗糖20g/L、琼脂3g/L,pH5.8,120℃灭菌20min),28℃,光照(光周期18h/6h,光照强度140μmolmuf02d2suf02d1)12~15h.将吸胀的大豆种子置于无菌吸水纸上,沿着种脐用手术刀纵向切割种子,将子叶和下胚轴均匀分开两瓣,去除种皮后备用.将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养皿中,放入大约50个外植体,室温侵染20~30min.将外植体取出,用无菌吸水纸吸干后置于放有无菌滤纸的共培养基(co-cultivationmedium,CM)上,每皿7~10个外植体.封口后在培养箱(Percival,美国)中23℃,黑暗共培养3~5天.CM培养基配方与LCCM相同,另加琼脂5g/L.1.4si培养基si的使用共培养后,将外植体转移到含筛选剂的芽诱导(shootinduction,SI)培养基上,SI培养基基本成分为B5培养基,外加蔗糖30g/L,2-(4-吗啉)乙磺酸(2-(Nmorpholino)ethanesulfonicacid,MES)0.59g/L和琼脂8g/L,pH5.8.120℃灭菌20min,冷却到50℃,加入抽滤后的BAP1.67mg/L、替卡西林(ticarcillin,Tic)250mg/L、头孢霉素(cephalosporin,Cef)100mg/L,培养基中还加入了标注浓度的草甘膦作为筛选剂.用透气胶带封口并转移到培养室(24℃,光周期18h/6h,光照强度140μmolmuf02d2suf02d1),每2周更换一次新鲜的SI培养基.SI培养4周后,切除残余子叶,并转移到芽伸长(shootelongation,SE)培养基上,SE培养基基本成分为MS(MurashigeandSkoog)培养基,外加蔗糖30g/L、MES0.59g/L、琼脂8g/L,pH5.8.120℃灭菌20min后,加入抽滤后的赤霉素(GA3)30.5mg/L,L-天冬酰胺(L-Asp)50mg/L,谷氨酰胺(Glu)50mg/L,吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)0.1mg/L,玉米素(zeatin,ZR)1mg/L,Tic250mg/L,Cef100mg/L及标注浓度的草甘膦筛选剂.培养条件同丛生芽诱导过程,培养2~8周,每2周更换一次SE培养基.将伸长3cm的幼芽切下,在吲哚丁酸(indolebutyricacid,IBA)中蘸30s后插入生根培养基(rootingmedium,RM)中,RM培养基含MS大量元素,MS微量元素和维生素,蔗糖20g/L,MES0.59g/L,琼脂8g/L,吲哚丁酸(indole-3-butytricacid,IBA)0.1mg/L,L-Asp50mg/L,Glu50mg/L,Tic250mg/L,Cef100mg/L,1~2周后待根长约2cm时,将生根苗从培养基中取出,洗净根部残留的培养基,转入土中移至温室培养.1.5出苗率和基因型肝移植的特征本研究中再生率为筛选4周后剩余外植体个数/占侵染外植体总数的百分率;出苗率为经转基因程序后生根苗株数占侵染外植体总数的百分率;转化效率为经分子及除草剂抗性鉴定后确定的阳性转基因苗株数占侵染外植体总数的百分率.1.6多序列比较与嵌入式树分析1.7ssr-pcr反应及检测T0代转基因大豆通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)检测.用基因组DNA简易提取法提取转基因幼苗的基因组DNA后用PCR进行检测.725bpEPSPS基因片段的引物序列为5′-GTACCGGCAGGCTGAAGTCC-3′(上游)和5′-CGGTCTGCACCATCGTCAAC-3′(下游).PCR反应结束后,制作1%的琼脂糖凝胶,将PCR产物点样电泳20min,用凝胶成像系统观察结果并拍照.T1代转基因苗用Southernblot检测.用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法抽提大豆叶片基因组DNA.30μg的DNA用XbaⅠ(Thermo,美国)完全酶切.酶切片段用1%的琼脂糖凝胶电泳分离并转移到尼龙膜上(Amersham,英国).EPSPS基因的PCR产物用地高辛试剂盒标记(RocheAppliedScience,瑞士).预杂交、杂交、洗膜和检测也根据试剂盒说明进行(RocheAppliedScience,瑞士).1.8半定量rt-pcr分析根据Trizol试剂说明抽提大豆幼苗叶片的总RNA(Invitrogen,美国).以M-MLV逆转录酶(Promega,美国)合成的cDNA第一条链为模板扩增目的基因,进行反转录PCR(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR).用大豆的ACTIN基因作为内参,再用EPSPS基因引物进行半定量RT-PCR分析.半定量RT-PCR所用ACTIN基因片段上、下游引物分别为5′-TCAATGTGCCTGCCATGTATGTG-3′和5′-CCAGCGAGATCCAAACGAAG-3′.EPSPS基因上、下游引物分别为5′-CATCTGCTCTGAGACCAAGAA-3′和5′-GCCATCCAAGAACTACACCAC-3′.1.9稳定型聚丙烯酰胺凝胶电泳大豆幼嫩叶片在液氮中研磨至粉末状后移至离心管中,加入预冷的蛋白提取液(0.1mol/L醋酸钾,20mmol/LCaCl2,2mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),0.1mmol/L苯甲基磺酰氟,20%甘油,pH5.4),混合均匀,12000×g,4℃,离心15min,取上清.用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上.将膜置于TBSTM(0.01mol/LTris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.05%Tween-20,5%脱脂奶粉)中,室温孵育1h;在TBSTM中按1/500加入EPSPS一抗,孵育1h;用TBST(0.01mol/LTris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.05%Tween-20)洗膜3次,每次5min;在TBSTM中按1/10000加入山羊抗兔二抗(康为,北京),孵育1h;用TBST洗膜3次,每次5min;在10mLTBST中加入适量33μL5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatep-toluidinesalt,BCIP)和66μL氯化硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium,NBT),混匀,将膜置于其中进行显色10min,烘干后照相.1.10田间药剂防治转基因大豆的草甘膦抗性检测首先在温室盆栽苗上进行,鉴定在幼苗1~3片三复叶时期进行,用1/200(体积比)的41%的农达药剂喷洒,剂量为植株叶面上有一薄层水膜.药剂喷施后5~7天统计植株对草甘膦的抗性.田间除草剂抗性鉴定在苗龄3周时进行,以2倍的生产剂量进行鉴定,即41%农达喷施剂量为6000g/hm2,5~7天后观察植株对草甘膦的抗性.2结果2.1抗草甘膦的先发基因在大豆细胞中的表达为了获得具有自主知识产权的抗草甘膦基因,将草甘膦污染土壤样品在含有50mmol/L草甘膦的M63培养基培养.由于M63不含芳香族氨基酸,存活和生长的细菌为抗性菌.获得的一株抗性菌株能在含200mmol/L草甘膦的M63培养基生长.扩增获得16SRNA后,经序列鉴定,发现它与Pseudomonassp.‘FSLR1-057’菌株(AF205137),Pseudomonasputida(AB180734)(AM184283)及Pseudomonasrhizosphaerae(AY866408)均有99%的相同性.因此获得的菌株来自假单胞杆菌(Pseudomonas).根据基因库Pseudomonasputida已完成基因组测序的基因序列资料,设计引物对其EPSPS基因进行了扩增,获得的产物用pMD18-T克隆并测序.结果发现它与Pseudomonas等已完成基因组测序的EPSPS相似.测序获得的EPSPS基因序列与其他已知抗草甘膦基因同源性较低.例如它与已知具有抗草甘膦的农杆菌CP4的EPSPS基因的氨基酸序列只有46.4%的同源性,与Pseudomonassp.PG2982的只有46.5%的同源性(美国专利:5633435).该序列转入大肠杆菌(Escherichiacoli)后能显著地提高大肠杆菌对草甘膦的抗性.为了将该基因用于作物转基因中,根据玉米(Zeamays)氨基酸密码子的使用频率,人工合成了编码PseudomonasputidaF1的理论预测蛋白质的EPSPS区域,定名为G6-EPSPS(EU169459).G6的功能在拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)、水稻(OryzasativaL.)(图2A)、玉米(图2B)中得到了验证,含G6基因的转基因水稻和玉米在喷洒草甘膦后生长良好,而非转基因植株整株枯死.以G6基因为筛选标记基因,进行了大量的大豆转基因工作,以携带G6基因的双元载体pSOY11(图1A)的农杆菌侵染的外植体数目达14700,但未能获得转基因幼苗.为了进一步鉴定G6基因在大豆中的效果,将35S启动子驱动的G6基因表达框装入双元载体pTF101.1后获得新载体pSOY12(图1B),以bar基因为筛选标记再转入大豆中,获得了22个转基因株系.草甘膦喷洒后,转基因植株的药害虽显著低于非转基因对照材料,但仍有明显药害(图2C),抗性不能达到生产要求.为了获得高抗草甘膦的目标基因,用以上方法,又克隆了多个菌株中的EPSPS基因,其中从抗除草剂的耐辐射球菌(DeinococcusradioduransR1)中克隆的EPSPS基因,基因库编码为AAF10666.1.该基因转入拟南芥后,含G10基因的转基因拟南芥在喷洒4500g/hm2的41%农达后生长良好,对照植株整株枯死(图3).基因编码的氨基酸序列比对发现,G10-EPSPS与CP4的同源性为32%,与G6-EPSPS的同源性为31%.CP4,G6-EPSPS及G10-EPSPS氨基酸序列同源性比对结果见图4.由于G10-EPSPS在转基因大豆中表现较强的抗除草剂能力,所以被用于本文后面介绍的抗草甘膦的转基因大豆研究.2.2液体共培养体系(ⅰ)受体基因型与转化效率分析.大豆转基因能否成功,很大程度上取决于受体大豆基因型对农杆菌的易感性及再生能力,因此,受体大豆的基因型是影响大豆转基因效率的重要因素.前期工作中通过瞬时表达率和再生率2项指标分析,筛选出适宜大豆遗传转化的华春3号、华春6号、天隆1号和威廉姆斯82等品种.将转基因体系的筛选标记改为草甘膦,鉴定了以上大豆基因型的转化效率.草甘膦筛选转基因体系的流程如图5所示,与报道的草胺膦筛选体系相比,该体系SE筛选4周后丛生芽发黄,而不是整棵褐化变黑.草胺膦筛选体系中表现优良的转基因受体品种天隆1号、华春3号、杰克和威廉姆斯82对草甘膦筛选体系反应良好,其中华春3号、天隆1号和杰克的平均转化效率为1%左右,威廉姆斯82的平均转化效率略低,约为0.8%(表1).(ⅱ)固体与液体共培养的比较.相比于以琼脂为介质的固体培养基,液体培养操作方便,在植物转基因研究中有很大的应用前景.在大豆遗传转化研究中,国际上已经报道了很多关于液体培养的技术,不仅是共培养,在筛选和分化等步骤中都采用液体培养方法.本研究比较了液体与固体共培养体系对大豆转基因效率的影响.实验选用基因型天隆1号,载体pSOY19,农杆菌菌株LBA4404分别进行5批子叶节外植体侵染实验.通过2种不同方法进行共培养,对外植体进行再生率统计.结果表明,液体共培养体系对大豆的再生率无显著影响(表2).但液体共培养体系可大大地节省培养基配制的工作量和培养基成本,因而推荐在今后的大豆转基因工作中采用.(ⅲ)草甘膦筛选浓度对转化效率的影响.按照农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法,用携带pSOY19载体的农杆菌LBA4404侵染大豆杰克的子叶节外植体,共培养后,用不同的草甘膦筛选浓度梯度(2.5~100mg/L)进行筛选.在不同草甘膦筛选浓度的SI培养基和相同草甘膦筛选浓度的SE培养基中各筛选4周后,外植体的生长状态出现明显差异.当SI培养基草甘膦筛选浓度在2.5~10mg/L时,外植体的丛生芽生长旺盛(图6A和C),筛选浓度为50mg/L时,外植体生长没有受到抑制;草甘膦筛选浓度为100mg/L时,丛生芽的诱导受到明显抑制(图6B和D).对外植体的再生率进行统计分析,结果表明,随着SI中草甘膦筛选浓度的增加,外植体的再生率呈下降趋势(图6E).其中,草甘膦筛选浓度在2.5~10mg/L时,再生率的差异较小,二次筛选培养后外植体的平均丛生芽再生率约为75%;筛选浓度上升到50mg/L时,再生率显著降低,约为50%;筛选浓度为100mg/L时,再生率下降至30%.实验结果表明,在SI培养阶段,随着草甘膦浓度增加,低浓度的草甘膦对外植体生长无显著差异,高浓度的草甘膦则显著抑制外植体生长.研究利用pSOY19及其5个衍生载体(除G10-EPSPS外携带一个目的基因)pnBT,pnsBT,pGMⅠ,pGMⅡ和pGMⅢ,比较了10和100mg/L2种草甘膦浓度筛选对最终转基因效率的影响.当丛生芽诱导、芽伸长阶段草甘膦筛选浓度分别从10和5mg/L提高到100和10mg/L时,即选择程序从10/10/5/5提高到100/100/10/10时,虽然再生率显著下降(图6E),但平均转基因效率仍达1.05%(表3),2种筛选程序的转基因效率在统计学上无显著差异.高浓度的草甘膦筛选抑制了非抗性丛生芽的生长,使抗性芽得到了更好的生长机会,同时在转基因过程中节省了大量培养基,因而推荐采用.2.3嵌入3g-mb-pcr阳性植株的ssr-pcr分析T0代再生大豆植株中目的基因的整合首先通过PCR检测进行.图7A展示了10个T0代植株的G10-EPSPS基因的PCR结果,其中L1,L2,S8,S9,S22和S24为PCR阳性植株;L3,S10,S11和S12为PCR阴性植株.为了验证G10-EPSPS基因在转基因植株中的表达水平,提取PCR阳性植株的RNA,逆转录成cDNA后,以大豆ACTIN作为内参,对转入的G10-EPSPS基因进行半定量表达分析,从图7B结果可见,以上PCR阳性植株的G10-EPSPS基因均有很高的表达量.对T1代转基因植株提取基因组DNA后,每个株系取2株样品,每个样品取30μg基因组DNA,用限制性内切酶XbaⅠ进行酶切,用地高辛标记EPSPSG10为探针后进行Southernblot鉴定.图7C结果显示,L1,L2,S8,S9和S22转基因事件均为单拷贝插入的独立转基因阳性株系.为了明确各转基因株系目的基因的蛋白表达水平,提取了L1,L2,S8,S9,S22和S24等6个株系的转基因大豆总蛋白,用G10-EPSPS的抗体进行Westernblot检测,图7D结果显示,6个待检测的转基因大豆样品中均能检测到48kD的目的蛋白,为转基因阳性植株.2.4t0抗转大豆t0的鉴定对温室种植的T0代转基因植株进行了抗除草剂的初步鉴定,除草剂浓度梯度实验表明,播种后3周的大豆幼苗喷施1/200(体积比)41%的农达1周后可以清楚地区分转基因与非转基因的大豆植株(图8A).用此方法,鉴定并筛选获得了T0代高抗草甘膦的转基因植株.对T1及T2代的转基因大豆植株,田间中间实验过程中选用了2倍的生产剂量,对转基因大豆进行了草甘膦抗性鉴定.如图8B和C所示,转基因大豆的后代出现了除草剂抗性分离,抗性转基因大豆植株能够正常生长,而分离出的阴性转基因大豆植株整株枯萎死亡.3抗杂草性能优良的基因受体类型及其用量我国具有自主知识产权的转基因大豆新品种选育仍处于研发阶段.本研究从草甘膦抗性基因克隆、功能比较、转基因体系建立等方面入手,开展了抗除草剂草甘膦的转基因大豆培育工作.完成了G6-EPSPS和G10-EPSPS2个抗草甘膦