一种提取肝组织中单胺氧化酶的方法

一种提取肝组织中单胺氧化酶的方法

人体衰退是一个渐进而复杂的过程。衰老是人体生理与病理过程相互作用的结果。生理环开始衰老，病理环加速衰老。衰老不是疾病,与疾病有不同的发生机理,但与疾病有着共生和相互促进的关系,多数情况下很难区分因病而衰还是因衰而病。美国哈佛医学院Wu在《人体革命》中称,按人体生长规律和基因特点推测,人类潜在寿命可达150岁,然而由于老年疾病的影响,恐怕无人能活到其自然寿限。在衰老过程中,各种单胺类神经递质对记忆形成和维持起着很重要的作用。机体内单胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO,EC1.4.3.4)的主要功能就是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢,具有重要的生理功能。人体中MAO的活性异常会使细胞内单胺类神经递质转运出现紊乱,产生诸多衰老疾病如老年痴呆症、帕金森综合征等。随着MAO活性的不断升高,不仅会导致脑生理功能的退化,而且还会引起整个机体逐步衰老。因此MAO被认为是老化的标志,故又称之为老化相关酶。本研究从老龄雄性大鼠肝脏中提取出单胺氧化酶,并进行了相关的定性定量检测,以该酶作为靶位酶所建立的抗衰老生物学体外模型可应用到功能性物质,如益生菌的筛选过程中。1材料和方法1.1犬尿胺、clor未定形Wistar雄性老年大鼠(上海斯莱克实验动物责任公司);犬尿胺、Clorgyline、Selegiline(Sigma公司);牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(国药上海化学试剂公司)。1.2高速冷冻离心系统ij30i、cat5SPECORD205型紫外分光光度计(德国耶拿公司);AVANTIJ30I型高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司);KAT25型高速组织分散器(德国IKA公司);XW-80A型漩涡混合仪(上海青浦沪西仪器厂);DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备公司)。1.3测试方法1.3.1肝脏组织mao的提取参考Hu等和Stafford等的方法并加以改进,从大鼠的肝组织匀浆中分离得到初级纯化的MAO。Wistar雄性老年大鼠通过断髓致死,无菌操作取出肝脏,在预冷的磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH值7.6)中洗涤后,贮存于-85℃待用。肝组织(5g)以1g∶40mL的比例在0.3mol/L蔗糖溶液中匀浆,采用低温差速离心法分离线粒体:将匀浆置于低温高速离心机1000g离心10min,弃沉淀,上清液经10000g离心30min,沉淀即为提取的肝脏粗线粒体,整个过程温度控制在0～4℃。将沉淀重悬于4mL0.3mol/L的蔗糖溶液中,充分混匀,上样于40mL,1.2mol/L的蔗糖溶液中,53000g离心40min即可得到纯度较高的肝脏线粒体,其中MAO定位在线粒体外膜上且结合紧密。用磷酸钾缓冲液将线粒体洗涤1次后,悬浮在40mL的该缓冲液中,即为MAO粗提物,分装成每管1mL,-85℃储存备用。1.3.2mao抑制剂的确定以阳性对照组(粗提物+底物),阴性对照组(pH值7.6缓冲液+底物),clorgyline组(粗提物+底物+clorgyline)和selegiline组(粗提物+底物+selegiline)对从老龄大鼠肝脏中提取得到的MAO进行确证,其中clorgyline和selegiline分别是MAO-A和MAO-B的专一性抑制剂,反应浓度均为10μg/mL。上述4组中粗提物均取50μL(阴性对照组以50μL缓冲液代替粗提物),加入1mmol/L的底物犬尿胺100μL及磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH值7.6)750μL。在360nm处测定初始吸光值,随后于37℃水浴保温1h,测定终点吸光值。以底物消耗作为酶活测定指标:酶活定义为37℃,pH值7.6条件下,1min内转化1nmol底物的酶量为1个酶单位(U)。1.3.3牛血清白蛋白的检测为了试验中MAO的定量,有必要测定其蛋白量。采用考马斯亮蓝G250的方法。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色,当与牛血清白蛋白结合时形成的复合物呈蓝色,最大吸收峰波长为595nm。考马斯亮蓝G250-蛋白复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后,在595nm处,测定的吸光值与蛋白含量呈线性关系。2结果2.1鼠肝脏匀浆粗提物中mao成分的鉴定国内MAO的提取流程普遍采用肝脏匀浆直接作为酶的来源,未对其中的MAO进一步纯化。本试验则对来源于肝脏的MAO进行了初级纯化,利用低温差速离心法获得的MAO纯度更高,有利于后续试验操作。老龄大鼠肝脏匀浆粗提物中MAO成分的确证详见表1。从表1发现,阳性对照组在含有粗提物的条件下,360nm处底物犬尿胺的吸光度明显下降,所对应的阴性组底物吸光度几乎没有变化,说明在粗提物中含有能促进犬尿胺消耗的活性物质;通过Clorgyline组和Selegiline组发现,当反应体系中加入了这2种化学合成药物后,底物吸光度下降程度明显减弱,说明clorgyline和selegiline对体系中催化犬尿胺消耗的活性物质具有显著的抑制作用,而clorgyline和selegiline分别属于MAO-A和MAO-B的专一性抑制剂,这就证明了在经过初步纯化的分离物中确实存在有MAO。2.2蛋白质含量测定试验中以牛血清白蛋白作为标准蛋白,以不同反应浓度(200、400、600、800、1000μg/mL)与考马斯亮蓝G250进行络合反应,测定在不同浓度下反应体系的595nm处吸光值,通过线性回归得到标准曲线。图1为蛋白质含量标准曲线,其线性相关性为0.9951,待测样品在595nm处所测得的吸光值为0.2879,通过方程计算出相应酶蛋白量为869.15μg/mL。根据酶活定义,并参考底物转化量及测定的蛋白含量,计算出肝脏粗提单胺氧化酶的绝对酶活为30.7U/mg。3mao活性测定单胺氧化酶活性异常所导致的诸多老年疾病以男性患者居多,因此本试验选取雄性老年大鼠肝脏作为单胺氧化酶的提取来源。试验中采用低温差速离心法获得了单胺氧化酶的粗酶液,并对单胺氧化酶进行了活性测定。通过阳性/阴性对照试验及MAO-A/B抑制剂反应试验证实