大豆转基因技术研究进展

大豆转基因技术研究进展

大豆最早起源于中国。它不仅是人类最重要的石油和植物种类，也是一个重要的工业原料。植物转基因技术作为一种新兴的生物技术手段,在提高产量、抗性育种以及缩短育种周期等方面有着明显的优势。早在1988年,McCabe和Hinchee分别用基因枪轰击大豆未成熟胚生长点和用农杆菌侵染大豆子叶节的方法获得大豆转基因植株。笔者对大豆转基因的研究与利用方面进行了综述,重点阐述了大豆转基因的主要方法,分析了大豆遗传转化的主要障碍及其可能的解决途径,探讨了转基因大豆的生物安全性问题,最后指出了大豆转基因技术的研究方向。1超声波辅助农杆菌转化的方法大豆转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等。其中,以农杆菌介导法和基因枪法为大豆常用的转基因方法。1.1大豆基因型的转化农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现,与植物基因转化有关的有两种类型:一为根癌农杆菌,含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成冠瘿瘤;二为发根农杆菌,它含有Ri质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染植物时,这段DNA可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到50kb的外源基因。因此,Ti质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。农杆菌转化的方法主要有整体植株接种共感染法和叶盘转化法。1985年,Horsch等发明了叶盘转化法,其操作方法是首先用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片,亦称之叶盘。目前,大豆农杆菌转化多采用的是改良叶盘法,外植体主要是子叶、下胚轴和子叶节等。用农杆菌介导进行大豆的转基因研究是从野生型菌株开始的,Owens研究了大豆品种对农杆菌的敏感性,Byrne等用21个大豆品种研究了大豆品种与农杆菌间的关系。2002年,王罡等研究表明大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性,不同大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差异。我国学者王连铮等利用致瘤农杆菌的15个菌系对2759个大豆品种的致瘤能力进行了研究,筛选出7个致瘤能力较强的菌系。Kudirka等研究了大豆基因型、农杆菌共培养时间对农杆菌转化的影响。Fscciot等将SSU(1,5-二磷酸核酮糖融化酶)、OSU(章鱼碱合成酶)和nptⅡ(新霉素磷酸转移酶)的融合基因通过农杆菌对大豆进行侵染转化,得到的抗性愈伤组织经检测后证明有融合基因的诱导表达。Hinchee等(1988)首次通过农杆菌介导转化获得转基因大豆植株。Di等用含有BPMV外壳蛋白基因的农杆菌侵染大豆,都获得了转基因植株。徐香玲等于1997年和1999年用农杆菌Ti质粒介导分别将Bt(苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因)和菜豆几丁质酶基因导入大豆,得到转化植株,经检测证明外源基因已整合到大豆基因组上。1999年苏彦辉等和Zhao等用农杆菌介导法分别得到转Bt基因和bar基因的大豆转化植株。2001年,赵桂兰等将nptⅡ和Barnase基因导入大豆的幼胚和子叶节中,筛选得到转基因植株,PCR检测证明nptⅡ和Barnase基因已整合到大豆基因组上,转基因植株生物学观察发现,花粉不育率达98%。姬月梅等用农杆菌介导法把与抗逆有关的小麦基因(TaNHX2)转入大豆,经检测证明目的基因导入并整合到大豆基因组中。目前,从大豆成熟种子分离出的具有选择性的子叶节作为受体进行转化,获得了较高的转化率,能够提高1.5倍,达到8.7%,这是大豆遗传转化率中较高的报道。农杆菌介导法具有技术简单成熟,耗资少,可靠性高,转化率相对较高,可以转移大片段外源基因(>30kb),没有明显的基因重排现象,外源基因主要以单拷贝插入植物基因组等优点。1.2金粉颗粒对小麦幼苗nptii基因表达的影响基因枪法又称微弹轰击法。这种技术是借用高压气体或高压放电为动力,用微粒对植物组织进行轰击而将其上的外源基因带入到植物细胞内,优点在于不受基因型和轰击靶组织的限制。Klein等首次在洋葱上对细胞进行试验,并在受体细胞中观察到了病毒RNA的复制。随后,他们还用这种技术将cat(chloram2phericolkacetyltrandferase)基因导入洋葱表皮细胞,并从被轰击的表皮组织的提取液中检测到很高的cat活性。Christou等用基因枪法转化未成熟胚,研究表明,金粉粒子深入到5~7层细胞,不同抗性愈伤插入nptII基因拷贝数不同,nptII酶活性不同。McCabe等(1988)以大豆芽分生组织为靶组织,经基因枪轰击获得转基因大豆,获得了转基因植株,但都为嵌合体。Sato等以大豆组织的不同部位(未成熟胚的芽尖和长期增殖悬浮培养物)为靶组织进行基因枪轰击,GUS染色和组织切片结果表明,轰击芽尖组织时GUS基因主要在细胞表层1~2层表达;轰击悬浮培养物GUS基因在表1层表达,即轰击的部位不同,被击入细胞的深度也不同。Moore等对大豆子叶大小、轰击压力、基因型等对基因枪转化的影响进行研究,认为GUS基因的表达是在表层或近表层,大豆未成熟子叶以4~5mm最好,轰击压力对GUS基因表达无影响,但在大豆基因型上存在显著差异。1999年胡张华等在研究影响基因枪遗传转化因子时发现,CaCl2浓度、氦气压力和受体状态等对大豆转化频率有重要影响,在基因枪轰击前24h,用5Gy辐射处理愈伤组织,转化效率获得了提高。后来,Hadi和Simmonds等又分别研究了多个质粒混合轰击共转化的效果,经hygromycin抗性筛选和Southern杂交检测,证明得到了共转化的克隆和再生植株。王萍等在研究影响基因枪转化效率时发现,未成熟子叶被轰击后在高渗培养基中停留的天数是影响大豆转化率的主要因素之一。目前,外源目的基因的转化仅有Bt基因和牛酪蛋白基因的成功报道,所用外植体为未成熟子叶或由未成熟子叶诱导产生的胚性悬浮培养物(细胞团)。基因枪法能将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体,对DNA的转移过程与基因型的依赖性没有任何生物限制。1.3利用抗卡那霉素进行基因转导电激法利用植物原生质体具有整合和表达外源DNA的能力,使细胞膜透性在电击处理下发生变化,出现一些可逆性孔隙,和原生质体膜直接接触的DNA分子可进入细胞,其中大部分DNA被细胞内酶降解,一小部分DNA整合到核基因组中,并可稳定遗传。质膜上可逆孔隙的大小、数量取决于电场强度、处理时间、溶液性质细胞种类等。此方法优点是可以一次转化许多原生质体,但须具备原生质制备、培养和再生系统。李宝健等首次应用该技术进行植物细胞的基因转化,并用此法获得了水稻转基因植株。用电激法对大豆的遗传转化报道很少,Christou等用3个大豆品种研究电激条件,得到了抗卡那霉素的愈伤,并诱导生根;Dhir等以Clark63为材料,分别得到抗性芽和抗卡那霉素植株。由于原生质体培养技术复杂、难以掌握,应用不广泛。1.4超声波处理对大豆胚性愈伤组织的影响超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用,击穿细胞,使外源DNA进入细胞。在进行农杆菌转化时用超声波处理外植体组织,使转化的靶组织内部或表面产生大量的微小伤口,有利于农杆菌进入植物细胞内。Trick等用扫描电镜及光学显微镜观察发现,超声波处理后使外植体表面及近表面产生大量的细小贯穿通道,农杆菌易于与植物细胞接触,从而促进转化过程。1998年Trick和Santarem等用SAAT法转化大豆胚性悬浮细胞发现农杆菌能顺利地进入胚性愈伤组织内部,并且发现超声波处理材料2s时,在27℃共培养3d,GUS表达高达36%,得到了含有外源基因的抗性愈伤。然而,未经超声波处理的子叶只有平均不到1%的GUS表达。FinerJJ等SAAT法转GFP基因获得相似的结果。1.5转化自我变异特征花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道,将外源DNA导入受体植物基因组中。花粉管通道法的基本原理是植物授粉后,花粉在雌蕊柱头上萌发形成花粉管通道,使外源DNA或基因进入胚囊,转化受精卵或其前后的细胞(卵、早期胚细胞)而自然发育成种子,观察其后代的变异,筛选出转基因植物。1991年雷勃钧等通过花粉管通道进行了外源DNA的导入,转化后代变异包括成熟期、株型、花色、种皮色、百粒重、蛋白质含量等。张国栋等将玉米自交系和大豆品种的DNA导入另一大豆品种中,其后代的突变率分别为10.00%和5.32%,出现了种子蛋白含量、株高、茎粗、结荚习性、倒伏性、每株分枝数与荚数、粒数与百粒重等性状变异。刘德璞在大豆中导入高抗花叶病的外源DNA,获得了生育期、生长习性、株高、节数、分枝数等倾向供体的变异性状,且对SMV的抗性也得到了提高。胡张华等将反义PEP基因转入浙春3号大豆品种中获得再生植株,并得到PCR检测结果。徐香玲等将几丁质酶基因转入大豆栽培品种中获得再生植株,分子杂交证明了几丁质酶基因已转入大豆中。用这些方法可以转移单基因孟德尔遗传的性状和多基因数量性状。该方法的优点有:(1)操作简单,无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程,可在大田、盆栽或温室中进行。(2)应用广泛,单胚珠和多胚珠的单、双子叶植物均可;育种时间短,在自花授粉的基础上只有部分外源DNA片段进入受体基因组,比较稳定。(3)适应于重组DNA分子的导入。但是,该方法的缺点也很突出,如转化效率非常低、可重复性不高等,因此,限制了其广泛的应用。1.6peg诱导法PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)多聚L-鸟氨酸等都是细胞融合剂。PEG分子量为1.5~6.0kDa,水溶性,pH从4.6~6.8,因多聚程度不同而异。它可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥,促使相互间的接触和粘连。另外,有实验证实,PEG是通过引起膜表面电荷的紊乱,干扰细胞间的识别,而有利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体。因此,称之为PEG诱导法。PEG直接转化方法对禾本科作物有重要作用,已经在水稻、高粱和小麦等重要粮食作物都获得了转基因植株。大豆的PEG介导法转基因在卫志明和南相日的研究中报道。Lin用PEG法把nptII和cat基因导入大豆原生质中,6h后检测到CAT酶活性,并获得有CAT酶活性的抗性愈伤组织。这种方法的成功率很低,所以应用受到限制。2大豆遗传转化的主要障碍和可能解决2.1大豆再生植株的研究进展大豆转基因是否能获得成功,再生体系的建立是必要的前提和基础。大豆再生体系建立主要工作是大豆的组织培养研究,大豆的组织培养研究始于20世纪60年代,但各种外植体的组织培养与再生植株都十分困难。目前,在大豆的组织培养中应用较多的体系主要有两个,即大豆子叶节经器官发生诱导不定芽产生再生植株和大豆未成熟子叶经体细胞胚胎发生诱导体细胞胚萌发植株。前者再生率高,易于培养,但用于遗传转化时易产生嵌合体,给后期的筛选工作带来许多麻烦。未成熟子叶的体细胞胚胎发生途径虽然可以克服嵌合体现象,但其对农杆菌较敏感,进行农杆菌转化时易受到伤害,转化率低。直到进入20世纪80年代我国此项工作才有报道。因此,进一步研究和优化大豆组织培养和遗传转化体系,建立新的、高效稳定的大豆组织培养体系是十分必要的。2.2双价抗虫或抗病基因从已经得到的大豆转基因植株看,多为组织培养能力较好,宜于再生的大豆品种,而生产上大面积栽培的品种因再生能力差,很少被用作受体,这对转基因大豆进一步在生产上利用受到很大的限制。因此,应进一步加强优化大豆组织培养体系的基础研究工作。从所转化的外源目的基因看,主要是转抗除草剂基因、Bt基因和几丁质酶基因等抗虫、抗病的单个基因。在植物转基因研究中,一个潜在的严重问题是害虫和病原体对单基因可能会产生抗性或耐受性。在基因构建时应采用组织专一性启动子或化学诱导启动子,或者同时转入多个基因,如转抗虫基因时,可同时使用2个以上Bt基因转化农作物或联合Bt基因和其他类型的抗虫基因(CpTI或Gna)。昆虫对2种独立杀虫剂同时产生耐受性基本上是不可能的。因此,使用双价抗虫(或抗病)基因可能是今后大豆转基因的一个方向。目前转入大豆具有实用价值的农艺性状的基因非常少。到目前为止,通过改进大豆的选择和植株再生、改造Vir基因构件、优化可疑大豆表型的鉴定和筛选方法,通过在培养基内附加vir区基因的化学诱导剂增强农杆菌的致毒力,通过利用超声波、轰击和真空抽滤等方法增加外植体的创伤,大豆的转化频率有所提高,但获得转基因大豆的效率还相当低,有必要研发更有效的技术方法进一步提高转化率。3环境安全性评价中的基因污染问题随着转基因作物商业化生产的不断发展,转基因技术在食品生产中应用范围的不断扩大。大量的转基因农产品己经直接或间接地制作为人们消费的食品,转基因食品的份额在传统食品市场中的比例不断加大,逐步走上人们的餐桌,进入人们的食物链。转基因技术能够提高粮食产量,解决世界人口增加与粮食短缺的矛盾,改善食品品质,满足人们提高生活质量的要求。但是转基因也带来了诸多新的问题,如目的基因漂移可能产生“超级杂草”、“超级病毒”;抗除草剂作物可能使农民加大除草剂的用量,而加重对生态环境的污染。环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间后,是否会将所转基因转移到野生植物中,是否会破坏自然生态环境,打破原有生物种群的动态平衡。人们对其引起的担心主要表现在以下3方面:(1)杂草化。释放到环境中的转基因植物通过花粉进行基因转移,可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给野生亲缘种或者杂草,而杂草一旦获得转基因生物的抗逆性,就将变成超级杂草,从而威胁其他作物的正常生长和生存。(2)转基因生物对非目标生物的影响。释放到环境中的抗虫和抗病类转基因植物,除对害虫和病菌致毒外,对环境中的许多有益生物也会产生直接或者间接的不利影响,甚至会导致一些有益生物的死亡。(3)对生物多样性和生态环境的影响。通过人工对动物、植物和微生物甚至人的基因进行相互转移,具有普通物种不具备的优势征,若释放到环境,会改变物种间的竞争关系,破坏原有自然生态的平衡,导致物种灭绝和生物多样性的丧失。转基因生物易通