高效液相色谱法测定连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量

高效液相色谱法测定连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量

连草是活血草科植物的一种昵称，头骨干燥，经络分散，皮肤香味，江苏金钱草；《中华人民共和国药典》2005年版收录了嘴唇科植物的活血丹龙目的（nakai）kubar干燥的土壤部分，具有润湿、祛瘀、杀瘀、祛斑的功能。对于连钱草药材的质量控制,《中华人民共和国药典》(2005年版一部)主要通过性状、显微特征和熊果酸的薄层色谱来鉴别药材的真伪,通过检查杂质、水分、总灰分和酸不溶性灰分以及测定醇溶性浸出物的含量来控制药材的质量。近年来,有学者相继报道连钱草中三萜酸类成分(主要为熊果酸和齐墩果酸)和总黄酮的含量测定方法,并以此来控制该药材的质量,但主要限于江苏、安徽两地产的连钱草药材。湖北省连钱草资源非常丰富,但其利用极为有限,主要在民间用于治疗少儿腹泻,笔者未见有关湖北产地连钱草药材质量控制方面的报道。笔者在本研究通过高效液相色谱(HPLC)法对5个湖北产地(8个批次)、3个其他省份连钱草中两种主要化学成分齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定并比较评价,同时对3种连钱草混淆品中的齐墩果酸和熊果酸进行考察,为湖北省连钱草资源的开发利用提供科学依据,也为连钱草药材质量控制标准的提升提供数据参考。1仪器和试剂盒1.1u3000试验设备SUMMIT型高效液相色谱仪(戴安,美国),包括ASI-100TM自动进样器,TCC-100柱温箱,PDA-100二级管阵列检测器,P680泵。超声波清洗器(JL.120,上海杰理科技有限公司)。旋转蒸发仪(SHZ-3,上海亚荣生化仪器厂)。1.2实验试剂与材料甲醇(色谱纯,FisherScientific),甲醇(分析纯,天津市博迪化工有限公司),乙腈(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),冰醋酸(分析纯,天津市博迪化工有限公司),实验用水均为双蒸水。齐墩果酸对照品(色谱级,上海友思生物技术有限公司),熊果酸对照品(色谱级)。连钱草样品见表1。连钱草自行采集后,除去杂质,自然晾干,粉碎,过筛孔内径960μm(20目)筛,使用前60℃干燥3h。另取恩施3的连钱草样品,将其茎和叶分开,待用。2方法和结果2.1决策及色谱条件色谱柱:大连依利特HypersilODS2(4.6mm×200mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液(40:40:20);流速:1.0mL·min-1;检测波长:210nm;柱温:30℃;进样量:20μL,所有待分析样品,进样分析前均用0.22μm有机系微孔滤膜过滤。理论板数按熊果酸色谱峰>13000,分离度>1.28;拖尾因子在0.99～1.02之间。图1和图2分别是在此色谱条件下测得的齐墩果酸和熊果酸对照品溶液和连钱草甲醇提取物的色谱分离图。2.2对照溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品0.0112g,用甲醇溶解并定容至25mL量瓶,摇匀,得齐墩果酸对照品储备液,浓度为0.448mg·mL-1。2.2.2对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品0.1000g,用甲醇溶解并定容至50mL量瓶,摇匀,得熊果酸对照品储备液,浓度为2mg·mL-1。分别取适量体积的齐墩果酸和熊果酸对照品储备液,用甲醇溶解并定容至10mL量瓶,摇匀,配制成一系列浓度的对照品溶液。2.3供试品溶液的制备分别称取各产地连钱草10g,加入50mL甲醇,超声提取30min,过滤,重复3次,合并滤液,减压浓缩,用甲醇溶解并定容至25mL,得供试品溶液。2.4齐墩乳酸和熊苹果的线性方程按照“2.2”项下方法配制一系列浓度的对照品溶液,以峰高(H)对浓度(C)进行线性回归,得齐墩果酸的线性方程H=229.69C-4.7558,r=0.9997;熊果酸的线性方程H=265.46C-18.937,r=0.9997。结果表明齐墩果酸在0.04～0.20mg·mL-1,熊果酸在0.40～0.75mg·mL-1有良好的线性关系。2.5样品的加样回收按照“2.2”项下配制对照品溶液3份,每份对照品溶液连续进样分析3次,测得齐墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分别平均为0.80%和0.37%。2.6进样稳定性试验称取同一批药材5份,按照“2.3”制得供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,测得齐墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分别为1.95%和2.73%。结果表明,该方法重复性较好。2.7溶液稳定性试验称取咸宁产地连钱草10g,按照“2.3”制得供试品溶液,在室温(25℃)放置0,1,2,4,6,8,10h后分别进样,按上述色谱条件分析,齐墩果酸和熊果酸峰高的RSD分别为1.24%和1.68%,结果表明,供试品溶液在10h之内稳定。2.8加样回收试验称取已知含量的咸宁产地连钱草5g,分别加入齐墩果酸对照品0.0014g、熊果酸对照品0.0084g,按照“2.3”制得供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,计算齐墩果酸和熊果酸的加样回收率分别为98.1%和97.9%(RSD分别为2.44%和1.83%,n=3)。2.9含量测定取11个批次连钱草、恩施3产地连钱草的茎、叶,按“2.3”制得供试品溶液,在上述色谱条件下进样分析,测定峰高,代入线性方程计算含量,结果见表2。3讨论3.1甲醇与三氯甲烷的提取效果采用超声提取法,考察三氯甲烷、甲醇、乙醇对连钱草中齐墩果酸和熊果酸提取效率的影响。结果表明,乙醇的提取效果最差,甲醇与三氯甲烷差异无显著性。考虑到三氯甲烷有较大的毒性,选用甲醇为提取溶剂。选用L9(34)正交表进行正交设计,考察提取时间、提取次数和提取体积对提取结果的影响。对正交结果进行极差分析表明,确定最佳的提取条件提取时间为30min,提取次数为3次,提取体积为50mL。3.2色谱波长的影响在线全波长扫描图显示熊果酸最大吸收波长在206nm处,但是在此波长处甲醇溶剂的干扰很大。而选择220nm为检测波长,熊果酸的色谱峰高显著降低。综合考虑,选择用210nm为检测波长。3.3流动相组成对熊乳酸分离度的影响根据文献,本实验对甲醇:1%冰醋酸水溶液和甲醇:乙腈:1%冰醋酸水溶液两种流动相组成及其比例进行优化。齐墩果酸和熊果酸的pKa分别为4.64和4.68。在流动相中加入冰醋酸,可抑制齐墩果酸和熊果酸解离,增加其在C18柱上的保留,从而增加二者的分离度。当流动相组成为甲醇-1%冰醋酸水溶液时,熊果酸的柱效较低,理论塔板数<12000;而当流动相中加入乙腈时,熊果酸的柱效显著提高,理论塔板数>15000。因此,选择甲醇:乙腈:1%冰醋酸水溶液为流动相组成成分。乙腈的含量对齐墩果酸和熊果酸的分离效果也有一定影响。当乙腈含量从10%增加到20%,分离度增加,从20%增加到40%,分离度不变,但乙腈的含量继续增加时分离度反而下降。考虑到柱效,本实验选择40%(V/V)的乙腈。综合以上结果,确定相对最优的色谱条件为:甲醇-乙腈-1%冰醋酸(40:40:20)为流动相,流速为1.0mL·min-1,柱温为30℃,检测波长为210nm。3.4样品含量测定结果表明,在上述11个批次的连钱草样品中,贵州安顺产地的齐墩果酸含量最低,江苏连云港产地的熊果酸含量最低。安徽六安产地的齐墩果酸和熊果酸含量都最高。比较湖北恩施1和湖北恩施2两个批次的连钱草样品,5月份采收的连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量高于9月份采收的连钱草;比较湖北荆州1和荆州2两个批次的连钱草样品,野生的齐墩果酸和熊果酸含量高于家种。总体而言,湖北各个产地连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量均较高,且差别不大,但不同省份之间差别较大。上述结果表明,连钱草药材的质量与其生长环境密切相关,与采收时间和栽培方式也有一定关系。比较恩施3茎、叶中齐墩果酸和熊果酸的含量,发现含量差异不大。说明茎和叶作为药用部位没有区别。另外,在实验过程中还比较混淆品种(湖北随州、四川1和四川2)与正品。结果表明,混淆品种的甲醇提取物中并没有齐墩果酸和熊果酸的色谱峰出现。这说明采用HPLC法测定齐墩果酸和熊果酸的含量,以此作为连钱草药材的质量控制标准之一是可行的。与前期紫外分光光度(UV)法测得的结果比较,H