镉积累模式不同的两个基因型烟草品种的积累特征

镉积累模式不同的两个基因型烟草品种的积累特征

重金属是影响叶片安全的重要因素之一。在重金属中，d具有毒性高、污染常见。易将其积累在叶片中，发芽强烈，并且具有高度的随机性，容易对人体造成损害。控制烟草制品中Cd的含量在减轻烟草重金属对人体危害方面意义重大。烟草制品中的Cd主要来源于烟叶生产过程,土壤是其主要途径之一。控制Cd从土壤向烟草转移的过程是控制烟叶中Cd含量的有效方法。国内外许多科技工作者研究了影响Cd从土壤向烟草迁移的因子,如:土壤理化性质、肥料、其他金属元素、陪伴阴离子Cl-等,相应也提出了一些控制措施。烟草对Cd的吸收存在显著的基因型差异,普通烟草(N.tabacum)和黄花烟草(N.rustica)有着不同的镉积累特性,前者表现为叶片和根系富集,而后者则为根系富集。对其他作物的研究发现,Cd的富集与其在亚细胞水平上的分布有关,但关于黄花烟草和普通烟草对Cd的不同富集特征与其细胞内Cd的亚细胞分布特点间的关系尚不清楚。因此,以Cd积累特征不同的两种烟草类型为对象,比较Cd在两类烟草中的亚细胞分布和化学形态的差异,探究产生烟草Cd积累基因型差异的原因,为利用生物技术控制烟叶中Cd的含量提供依据。1材料和方法1.1水培营养液和cd溶液供试烟草品种选用普通烟草品种K326和黄花烟草品种N.rustica。水培营养液采用1/4浓度的Hoagland完全营养液。Cd溶液以分析纯CdCl2·5/2H2O配制。样品消解所用HNO3,H2O2均为优级纯。1.2培养条件的基础烟草种子经浸泡、灭菌、消毒后于28℃黑暗条件下催芽,发芽后移入蛭石培养基中培养至6叶1心期,选取大小一致的烟苗,用去离子水冲洗干净后移至营养液中培养1周后备用。烟苗培养所用容器为体积1.5L的塑料盆,每盆定植6株。烟苗培养在恒温光照培养箱中进行,控制条件为光照16h/d,温度28℃(昼)/18℃(夜),相对湿度70%。培养期间每3d更换1次营养液,营养液用0.1mol·L-1NaOH或0.1mol·L-1HCl调节溶液pH至6.0左右。1.3烟株根系的取样试验设置低Cd(1μmol/L)和高Cd(50μmol/L)两个处理水平,每处理设置3个重复。烟苗在营养液中培养1周后进行Cd处理,除Cd处理外,培养条件与前期相同,Cd处理10d后取样。取样时,烟株根系先用自来水冲洗,然后置于20mmol/LNa2-EDTA溶液中交换20min以除去根系表面吸附的Cd2+,最后用去离子水冲洗干净,吸水纸吸干表面水分后分根、茎、叶取样。取样所得根、茎、叶材料,一部分立即置于-20℃保存,供亚细胞组分和赋存形态测定;另一部分于70℃下烘干至恒重,称量、磨碎用于烟株Cd全量测定。1.4分析1.4.1亚硝酸根的分离采用差速离心法进行亚细胞组分分离,具体操作参照周小勇等的方法。1.4.2分离并提取细胞内的cd化学形态采用化学试剂逐步提取法,具体操作参照于方明的方法。1.5cd含量的测量1.5.1混合酸微波消解hno3-h12的制备称取0.1g粉碎干样,用5:2(体积比)的HNO3-H2O2混合酸微波消解,消解完全后用超纯水定容,Cd含量由石墨炉原子光谱仪(PerkinElmer800)测定。1.5.2评价沉淀和残渣中c的含量沉淀和残渣组分于80℃下水浴蒸干后,按照植株Cd含量测定方法测定。1.5.3上清液体成分的cd含量1.6数据分析所有数据采用Excel软件进行统计和作图,采用SPSS16.0软件LSD法进行差异显著性分析。2结果与讨论2.1cd对烟草幼苗生长的影响图1显示,随着Cd处理浓度的升高,2个烟草品种生物量均呈降低趋势。Cd处理浓度为50μmol/L时,K326生物量显著低于对照和1μmol/LCd处理,N.rustica的生物量各处理间差异不显著。说明1μmol/L和50μmol/L的Cd处理对两种烟草幼苗生长均有一定的抑制作用,随着Cd浓度的升高抑制作用增强,且对K326的抑制程度大于N.rustica。50μmol/LCd处理时,两种烟草均表现出明显毒害症状,叶片萎黄,植株矮小,根系变为浅红棕色,K326的毒害程度大于N.rustica,与生物量的降低趋势一致。2.22n.关于cd根系积累特征由图2看出,在营养液中Cd浓度为1μmol/L时,2个基因型烟草表现出不同的Cd积累特性。K326叶片中Cd含量是N.rustica的1.82倍,但N.rustica根系Cd含量是K326的7.80倍,K326和N.rustica中Cd含量的根叶比分别为1.12和16.03,黄花烟草表现出明显的Cd根系积累特征,与前人研究结果一致。在50μmol/LCd处理时,2种烟草叶片和根系中Cd含量均显著提高,尤以K326根系Cd含量提高最为明显,2个基因型烟草均呈现出Cd的根系积累特性,说明将大部分的重金属积累在根系是作物抵御重金属毒害的一种机制。2.32cd的累积特征表1显示,在2个Cd处理水平下,两类烟草中Cd在各亚细胞组分中的分布趋势相似,根系和叶片各亚细胞组分中的含量由高到低依次为:可溶性组分、细胞壁组分、细胞核和叶绿体组分、线粒体组分,所有的处理及部位中可溶性组分Cd的含量均显著高于其他组分。Cd浓度为50μmol/L时,细胞壁组分Cd的含量增加,显著高于细胞器和细胞核组分。说明2个基因型烟草根系和叶片中的Cd主要积累于以胞液为主的可溶组分中,随着Cd处理浓度的升高,细胞壁组分结合Cd的能力明显增强,细胞器和细胞核组分中Cd积累较少。虽然2个基因型烟草各亚细胞组分中Cd含量的大小趋势一致,但不同组分对Cd的结合强度存在一定的差异。由图3看出,Cd处理浓度为1μmol/L时,N.rustica根系中可溶组分结合的Cd占总量的73.50%,高于K3266.97百分点,叶片中可溶组分结合的Cd却低于K3269.28百分点,为总量的47.21%。2个基因型烟草中Cd在可溶组分结合的比例与其相应部位Cd积累总量的趋势一致。说明低浓度Cd处理下液泡对Cd的截留可能是造成两个基因型烟草不同Cd累积特征的影响因素之一。Cd处理水平提高到50μmol/L时,K326叶片和根系中细胞壁组分结合Cd的比例显著上升,根系中由1μmol/L时的17.32%上升到31.22%,叶片中由26.24%上升到86.64%;同时可溶组分的含量明显下降,根系中由1μmol/L时的66.53%下降到46.19%,叶片中由56.49%下降到31.80%。但是N.rustica根系和叶片中Cd在各组分中的分配比例没有明显变化,仍以可溶组分的结合为主。说明高浓度Cd处理下,K326细胞壁对Cd的固持作用得到增强,细胞壁固持也成为其富集Cd的影响因素之一,这与一些Cd超富集植物研究结果相一致。可见,造成N.rustica根系积累Cd的主要原因与其根系中液泡对Cd的截留能力有关,而造成K326叶片中Cd积累的原因与液泡和细胞壁的截留均有关。2.42cd的赋存形态表2和图4结果显示,在Cd处理水平为1μmol/L时,2个基因型烟草根系中Cd均以乙醇提取态含量最高,分别占到各化学形态总量的72.15%和71.36%,之后是氯化钠提取态和去离子水提取态,其他形态所占比例均非常低;2个基因型烟草叶片中Cd主要以氯化钠提取态(分别占总量的54.22%和54.52%)和去离子水提取态(分别占总量的37.36%和37.89%)存在,其余形态含量较少。Cd处理水平升高到50μmol/L时,K326和N.rustica根系中乙醇提取态Cd所占的比例明显下降,去离子水提取态和醋酸提取态比例升高;叶片中Cd赋存形态的变化主要是去离子水提取态比例有所下降,氯化钠提取态比例有所升高,Cd的赋存形态存在由活性较强的结合形态向活性较弱的结合形态转化的趋势,这与于方明和吴菁等的研究结果类似,说明蛋白质、氨基酸等配体分子在烟草减轻Cd毒害中起重要作用。但是2个基因型烟草中Cd的化学形态没有显著的种间差异,说明2个基因型烟草对Cd积累的差异与其化学赋存形态关系不大。3cd的沉积特征(1)K326和N.rustica显示不同的Cd积累特征,且与浓度有关。低Cd浓度下,K326表现为根系和叶片积累,N.rustica以根系积累为主;高Cd浓度下均显示根系积累特性。(2)K326和N.rustica中Cd主要结合于可溶组分中,K326中Cd的亚细胞分布还受Cd浓度的影响,高Cd浓度时K326细胞壁对Cd的截留能力显著升高,可溶组分的截留能力下降。(3)2个基因型烟草中可溶组分结合Cd的比例高低与2个基因型烟草相应部位所积累Cd的总量大小相一致,Cd在