丛枝菌根真菌对烟苗生长、营养状况和生理活性的影响

丛枝菌根真菌对烟苗生长、营养状况和生理活性的影响

优良的多分枝细菌根菌（尤其是磷）可以促进寄生植物的生长，改善植物的营养状况（尤其是磷），改善植物的抗逆性，提高移植成活率。因此，该菌根生物技术在可持续农业生产中具有广阔的应用前景。AM真菌目前尚不能离体培养,田间接种菌剂用量大,工作繁重,所以,AM真菌的田间应用主要以移栽菌根苗为主。烤烟漂浮育苗是将种子直播于装有基质的浮盘中,漂浮于营养液上的一种育苗技术。目前,我国每年推广烤烟漂浮育苗75万hm2,占育苗总量的74%以上。将菌根技术与烤烟漂浮育苗结合,生产菌根烟苗,移栽大田后可使AM真菌在与土著真菌竞争的过程中处于优势地位,充分发挥菌根效应。但AM真菌的种间,菌株间甚至不同生态型的菌根效应存在显著差异,在烤烟漂浮育苗条件下,接种AM真菌能否产生菌根效应,改善烟苗营养状况(特别是磷)、生理状况和促进生长稀见报道。试验选择了4株AM真菌,于播种期接种烟苗,在烟苗成苗期测定其真菌侵染、生物量,植株营养状况和生理活性,以筛选出适宜菌株,探索AM真菌促进烤烟生长,提高烟苗素质的机理。1材料和方法1.1菌株和培养基AM真菌4株,即根内球囊霉2株(GlomusintraradicesSmith&Schenck,BEGNumber141,193,简称BEG-141和BEG-193)、摩西球囊霉1株(GlomusemosseaeGerdemann&Trappe,BEGNumber167,简称BEG-167)和幼套球囊霉1株(GlomuseetunicatumBecker&Gerdemann,BEGNumber168,简称BEG-168),均由中国农业大学李晓林教授提供。AM真菌接种物是盆栽扩繁后,含培养基质、孢子、菌丝和侵染根段的混合物。烤烟品种为K326,由贵州省遵义烟草分公司提供。烤烟漂浮育苗专用基质(总空隙度85%,电导率700μs/cm,pH6.2,有机质49.1%,有效氮594.7mg/kg,速效磷25.6mg/kg,速效钾571.3mg/kg)由重庆市武隆烟草分公司提供。1.2种子处理和养分营养液制备播种时分别接种供试菌株(BEG-141,BEG-167,BEG-168,BEG-193),以不接种为对照,共5个处理。每个处理种植烟苗96株,重复3次。试验时,将基质灭菌(121℃,1h),加无菌水润湿后,装入浮盘孔隙内,每穴6g;再将0.5g接种物埋入3～5mm深的基质中,形成接种处理,对照为埋入等量灭活接种物。每穴播种3粒烤烟种子,出苗后留1株。在水池中漂浮培养,营养液为稀释后的Hoagland营养液,营养液中氮、磷、钾浓度分别为52.5mg/L、3.2mg/L和58.5mg/L,其他大量元素为正常浓度的1/4,微量元素的浓度不变。试验在人工控制温度、光照和湿度的培养室中进行。培养期间的光照强度14000～15000lx,每日光照13h,昼夜温度31～20℃,湿度60%～80%。1.3不同处理对烟苗根系增强的影响从出苗第10d开始,每隔5d每处理取5株烟苗称取植株鲜重,然后剪下根系,经0.01%酸性品红乳酸甘油染色液染色后,在普通光学显微镜下观察真菌结构,并估算侵染率。在成苗期(出苗后55d),每处理取15株烟苗,用自来水和去离子水依次清洗;随机切取不同部位的鲜根0.5g,切成0.5cm根段,用根段频率标准法测定根系侵染率。剩余样品105℃杀青30min,于70℃烘干至恒重后粉碎样品,H2SO4-H2O2消化,分别用蒸馏法、钒钼黄比色法和火焰光度法测定植株的N、P、K含量。每处理另取15株烟苗,用80%丙酮提取,比色法测定叶绿素含量,NBT比色法测定叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性,磺胺比色法测定根系硝酸还原酶(NR)活性,N-乙酰氨基葡萄糖比色法测定根系几丁质酶活性。试验数据统计分析采用Excel2000和SPSS11.5进行。2结果与分析2.1出苗生长“控制点”由图1可见,各处理烟苗生物量增长的趋势基本一致,出苗后45d前,各处理烟苗生物量增长缓慢,出苗45d后,生长出现“拐点”,叶面积迅速扩大,茎的生长明显加快,植物生物量迅速增加。其中,接种BEG-141,BEG-167和BEG-168的处理烟苗生长“拐点”出现在出苗后第45d;而接种BEG-193和对照的生长“拐点”出现较晚,约在出苗后第50天。2.2苗期真菌初始感染情况通过对根系侵染率的连续观察,接种BEG-141和BEG-167后,烟苗出苗后第20d可观察到菌丝侵入根系和根内菌丝的生长(图2a、b);接种BEG-168和BEG-193后,第25d也可观察到AM真菌的侵染。出苗后第25～40天,各接种处理的烟苗均出现根内菌丝、丛枝和根外菌丝(图2c、d、e),其中,BEG-141和BEG-167发育较快,在接种后第35天即达到较高的侵染率,而达到同样的侵染程度,BEG-168和BEG-193分别比BEG-141和BEG-167晚5d和10d。第45天接种BEG-141的根系内出现泡囊(图2f),第50天接种BEG-167的烟苗出现根外孢子(图2g),此时BEG-168和BEG-193处理的根系内外均未见泡囊和孢子。AM真菌侵染的根系在外观上明显不同于对照,侵染根系颜色发黄,二、三级侧根较多,而对照根系接近透明,侧根少(图2h)。2.3菌根及其根系干重镜检成苗期的烟苗根系发现,接种AM真菌后,根系内均出现真菌结构,对照未见。说明接种AM真菌可以侵染烟苗根系,形成菌根,但侵染率因菌株种类不同而异,4株AM真菌的侵染率BEG-141≥BEG-193≥BEG-168>BEG-167,说明不同菌株与烤烟根系的亲和力不同,BEG-141的亲和力显著高于BEG-167和BEG-168(表)。此外,在镜检中还发现,BEG-141和BEG-167侵染根系后,根外菌丝较多,另2株的根外菌丝较少。表中结果表明,接种BEG-141、BEG-167和BEG-168后,烟苗干重和地上部干重显著高于对照和接种BEG-193的处理,BEG-193处理的地上部和根系干重与对照无显著差异。此外,各处理的根系干重差异均不显著,说明AM真菌对烟苗的促生效应主要表现在地上部。烟苗接种AM真菌后,BEG-141的菌根相对依赖度最高,促生效应最好;BEG-167和BEG-168次之;BEG-193最差。AM真菌显著影响烟苗的根冠比,菌根苗的根冠比显著低于对照,原因是菌根苗的地上部生物量增加,而地下部与非菌根苗相似。2.4磷、磷和钾含量从图3看出,接种AM真菌显著提高烟苗磷含量(BEG-193除外),但烟株氮、钾含量变化不大。接种BEG-141、BEG-167和BEG-168,烟苗含磷量分别比对照提高了35%、38%和45%。但接种BEG-193,烟苗氮、磷和钾含量不仅低于其他接种处理,还低于对照。由此可见,AM真菌对烟苗营养状况的影响因菌株而异,BEG-141、BEG-167和BEG-168的菌根效应较强,显著改善植株营养(尤其是磷)状况,而BEG-193基本无效。2.5烟气苗中硝化酶活性的变化由图4可知,AM真菌显著改善烟苗的生理代谢。接种BEG-141、BEG-167和BEG-168后,烟苗的叶绿素含量分别比对照提高了32%、38%和26%;烟苗根系硝酸还原酶活性分别比对照增加94%、110%和135%;烟苗根系的几丁质酶活性分别是对照的2.9、2.3和2.4倍。接种BEG-141显著提高烟苗叶片SOD活性,比对照增加46.6%;接种BEG-167有增加的趋势;而接种BEG-193对上述各项生理指标均无显著影响。3am真菌在烟苗生长中的作用1)菌根效应与AM真菌和宿主之间的亲和力密切相关。侵染率反映真菌的感染情况,是AM真菌功能发挥的基础。试验表明,供试菌株均能侵染烟苗根系,在出苗后20d能清楚观察到AM真菌侵染根系,并在成苗期形成一定数量的丛枝、泡囊和根外孢子。说明,在漂浮条件下,即使根系生长环境中的水分含量很高,AM真菌仍能侵染烟苗根系,形成菌根,烤烟幼苗与AM真菌有较高的亲和力。2)在烟苗根系内,AM真菌的不同菌株发育状况不一样。BEG-141和BEG-167侵染烟苗根系快,发育早,BEG-193达到同样程度明显晚于前两者。BEG-193在根内的快速发育恰在烟苗的生根期,烟苗生长以新生侧根为主,若真菌结构在根内大量发生和发育,势必与新生侧根争夺光合产物,延迟根系的形态建成,进而顺延烟苗茎叶的快速生长期。所以,在烟苗生长曲线上(图1),BEG-193菌根苗快速生长的“拐点”迟于BEG-141和BEG-167,这可能是成苗期后BEG-141和BEG-167菌根苗生物量显著大于BEG-193菌根苗的原因之一。有研究发现,接种后的早期快速侵染是优良AM真菌的重要特征之一,优良菌株一般都能够迅速侵染率寄主根系。在菌根形成之后,促生反应在早期通常比较显著。因此,早期的快速侵染可作为选择优良菌株的重要指标。3)AM真菌的不同菌株对烟苗所产生的菌根效应不一样。用养分(尤其是磷)浓度较低的营养液培育烟苗,接种BEG-141、BEG-167和BEG-168显著提高了烟苗含磷量和吸磷量,显著提高了烟苗生物量。这可能是菌根外延菌丝增大了根系的吸收面积,以及分泌磷酸酶,活化基质中的磷酸盐而增加了烟苗的养分供应。接种BEG-141、BEG-167和BEG-168后,烟苗叶绿素含量、硝酸还原酶活性、SOD活性(BEG-168除外)、几丁质酶活性均显著高于对照。叶绿素含量与光合强度有关,硝酸还原酶活性反映了还原和利用硝态氮的能力,几丁质酶是重要的病程相关蛋白,与植物对病原微生物的抗性有关。本试验结果说明,接种AM真菌能改善烟苗生理状况,提高烟苗素质,为菌根烟苗在烤烟生产中的应用奠定了良好的基础。4)AM真菌的菌根效应由真菌菌株、宿主植物和土壤生态条件等共同决定,其中,真菌因素尤为重要。同一种AM真菌的不同菌株,甚至同一菌株的不同生态小种或地缘小种在功能和菌根效应等方面都可能表现出较大的差异。BEG-167的侵染率在4株菌株中最低,但在改善烟苗营养状况,促进生理代谢,提高烟苗生长速率等方面却表现出较强的菌根效应。BEG-141和BEG-193是同一个种(Glomusintraradices)的不同菌株,对烟苗都有较高的侵染,但菌根效应却差别很大,BEG-141和烟苗形成良好的共生状态,而BEG-193基本是寄生。刘文科等认为,寄主生长环境与菌种分离地环境的生态条件越接近,AM真菌的菌根效应越明