山楂叶总黄酮提取工艺研究

山楂叶总黄酮提取工艺研究

山楂是蔷薇科植物的一种回族植物。请注意，它含有大量黄酮类化合物，如牡荆素、牡荆素-4'、牡荆素-4'、七-葡萄糖苷、琥珀酸乙酯籽，对心脑血管疾病有显著疗效。有关山楂叶总黄酮提取研究报道最多的是乙醇提取法和以乙醇为介质的新方法,如吕帮玉等对超声强化山楂叶总黄酮的提取工艺进行了研究;王立娟等探讨了微波辅助提取山楂叶总黄酮的条件;李宏伟等研究了超高压提取山楂叶中黄酮类化合物的工艺参数。这些方法虽然提取率高、提取液的杂质含量少,但其提取过程乙醇的消耗量大,乙醇回收能耗高,再加上新方法所需设备投资费用高和原料处理量过小问题,因而不适宜一些中小企业的工业化生产。山楂叶总黄酮的另一种提取方法是水浸提法,如周桂等报道超声波法水提取山楂叶中黄酮的研究;郭永学等以水为浸提剂,对山楂叶总黄酮的微波辅助萃取工艺条件进行了研究;这两种方法同样涉及所需设备投资费用高和原料处理量过小问题。王晓等报道酶法提取山楂叶中总黄酮的研究,其提取介质水溶液pH为4.5,考虑到该酸度对设备的腐蚀及提取废液的污染问题,也不是工业化生产的最佳方法。相比之下,单纯的水浸提法虽然提取率稍低、提取液的杂质含量高,但其投资成本低、可操作性强以及对环境的污染小,是最具有工业化前景的提取方法。目前大孔吸附树脂用于精制山楂叶总黄酮的研究报道最多,主要涉及树脂型号有D101和HPD-600,根据这些文献分析,D101型大孔吸附树脂法具有吸附快、解吸率高、产物纯度高及树脂再生简便等特点。此外,文献报道,采用ZTC-II型天然澄清剂对山楂叶总黄酮酶解提取液进行处理,在不影响活性成分黄酮的情况下,有效除去提取液中的鞣质、蛋白质等不稳定成分,使提取液得到澄清;可以弥补水浸提法的不足,如提取液对树脂的污染,树脂的吸附-解吸速率慢等问题。因此,本文重点考察山楂叶总黄酮单纯水浸提法工艺,然后在用吸附澄清剂预处理的基础上,探讨和大孔吸附树脂精制耦合综合工艺。1材料和方法1.1仪器和试剂山楂叶:山西中晋药业有限公司,使用前用清水洗净,置于烘箱在60℃下干燥,然后粉碎过20目筛保存备用;芦丁对照品:中国药品生物制品检定所;ZTC-II型天然澄清剂:天津正天成澄清技术有限公司,其A组分用蒸馏水配制成1%的水溶液,预溶胀24h;B组分用1%醋酸溶液配制成1%的溶液,预溶胀24h;D-101树脂:天津市海光化工有限公司;甲醇、乙醇、亚硝酸钠和硝酸铝均为分析纯。UV-2550PC紫外可见分光光度计:日本岛津公司;AB204-S型分析天平:瑞士METTLERTOLEDO公司;LABOROTA4000旋转蒸发仪:德国Heidolph公司;EYELAFDU-2200型冷冻干燥机:日本ThermoElectron公司;SHZ-III型循环水真空泵:上海亚荣生化仪器厂;PHSJ-A精密pH酸度计:北京光学仪器厂;玻璃层析柱:Φ30mm×500mm。1.2山楂叶总黄酮的代谢1.2.1来水用量的测定将芦丁标准品于120℃下干燥至恒重,准确称取芦丁0.0146g,用60%(体积分数,下同)乙醇溶解,定容于50mL,得浓度为0.292g/L芦丁标准液。精密量取芦丁标准溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL于25mL容量瓶中,加入5%的NaNO2溶液0.75mL,摇匀,放置6min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.75mL,摇匀,放置6min后加入4%NaOH溶液10.0mL,用30%乙醇定容,摇匀,10min后于510nm处测定吸光度A。计算得芦丁含量Y(mg/L)与吸光度X间的回归方程为:Y=0.0111X+0.0107,r=0.9997,线性范围为0mg/L~150mg/L。1.2.2萃取物的制备准确称取5.000g山楂叶粉末装入滤纸筒,用脱脂棉封口后置于索氏萃取器中,用150mL甲醇萃取,80℃水浴加热回流,待索氏萃取器中的萃取液接近无色时(约6h)结束。将萃取液真空浓缩回收甲醇至近干,用60%乙醇溶解所得萃取物并定容至250mL。然后按照测定芦丁标准液吸光度的测定条件测定吸光度。重复测定3次,结果取平均值。1.2.3黄酮的测定1.2.3.提取山楂叶总黄酮的测定先把液体样品定容至适当体积,过滤,弃去初滤液,精密量取滤液1mL,置于50mL容量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀。再从中取2.0mL于25mL容量瓶中,以下操作同1.2.1,测定山楂叶总黄酮含量(试验重复3次,取平均值);计算山楂叶总黄酮的提取率。提取率按公式(1)计算。1.2.3.山楂叶总黄酮纯度的测定精确称取黄酮提取物0.1000g,用95%乙醇定容至25mL,摇匀,过滤,弃去初滤液,精密量取滤液0.5mL,置于25mL容量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀。再从中取5.0mL于25mL容量瓶中,以下操作同1.2.1,测定山楂叶总黄酮含量(试验重复3次,取平均值);计算山楂叶总黄酮的纯度。总黄酮的纯度按公式(2)计算。1.3山楂叶黄酮的制备山楂叶→粉碎→加水微沸提取→离心分离→上清液真空浓缩→预处理(吸附澄清)→过滤→调pH值→滤液上柱吸附→解吸→浓缩→干燥→山楂叶黄酮产品1.4山楂叶总黄酮提取试验设计1.4.1单因素试验设计影响水浸提山楂叶总黄酮得率的主要因素有预浸泡时间、料液比(g/mL)、提取时间和提取次数等,分别对其进行单因素试验与分析,以确定各因素的影响效果及适宜范围。1.4.2水浸提山楂叶总黄酮的提取工艺根据单因素试验与分析结果,以山楂叶总黄酮得率为考察指标,选择正交试验的因素水平,按照L9(34)正交表对水浸提山楂叶总黄酮的工艺进行研究,提取次数为2次时合并2次提取液,真空浓缩至原体积1/2;提取次数为3次时合并3次提取液,真空浓缩至原体积1/3;确定该法提取的最佳工艺参数。1.5山楂叶总黄酮的提取按1.4.2所确定的最佳条件进行山楂叶总黄酮的提取,离心分离,合并2次滤液,真空浓缩至原体积的1/2。山楂叶总黄酮水浸提液的澄清试验。将山楂叶总黄酮的浓缩液按1.0g/L的用量加入预先配制好的ZTC-Ⅱ型天然澄清剂B组分,在40℃下作用30min;再加入已配制好的A组分(其用量为0.5g/L),继续作用30min。然后以3500r/min离心15min,倾出上清液,用6mol/LHCl调pH值4.5~5.5,继之,用蒸馏水调质量浓度至1140mg/L即得到上柱溶液。1.6大孔吸附树脂、山楂叶总黄酮试验1.6.1树脂柱的配置称取D-101大孔吸附树脂40g,用95%乙醇浸泡树脂24h,充分溶胀后,除去悬浮于表面碎小的树脂,用湿法装柱,测量柱体积约为32mL,继续用95%乙醇浸泡,控制流速为1.5mL/L通过树脂柱,冲洗至流出液与水(1:5)混合无白色浑浊为止,用蒸馏水平衡树脂柱,至树脂不再下降,流下的洗液无醇味时即可。1.6.2总黄酮的吸附D101大孔吸附树脂对山楂叶总黄酮的动态吸附-解吸试验。进行动态吸附条件:精密量取上柱液128.0mL,以1.0mL/min的上柱速率通过树脂柱。待溶液降至树脂柱表面后,用蒸馏水淋洗(2mL/min)至无色并用浓硫酸检测至无糖反应,收集流出液并测量其体积,测定解吸前流出液总黄酮含量(mg/L);再用70%乙醇洗脱至洗脱液无色为止,洗脱剂的流速2.0mL/min,收集乙醇洗脱液128.0mL,测定其总黄酮含量(mg/L)。分别按公式(3)和(4)计算总黄酮的吸附率和解吸率。式中:A为总黄酮的吸附率,%;B为上柱液总黄酮量,mg;C为解吸前流出液总黄酮量,mg;D为总黄酮解吸率,%;E为70%乙醇洗脱液中黄酮总量,mg。1.6.3上柱、吸附和洗脱按照1.6.2所述吸附、洗脱条件,移取山楂叶总黄酮上柱液进行上柱、吸附和洗脱,在同一根树脂柱上重复操作6次。根据6次总黄酮吸附率和解吸率考察树脂重复使用效果。1.7山楂叶黄酮精制品的制备将所收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇,经真空冷冻干燥,再真空干燥(80℃)后,得山楂叶总黄酮精制品,称重(重复3次,取平均值)。按1.2.3项下操作测定总黄酮含量,计算总黄酮的纯度。2结果与分析2.1总黄酮含量的测定按照1.2.2的测定方法测得山楂叶中总黄酮的平均含量为2.52%。该结果视为山楂叶中总黄酮的实际“真实”含量,作为考察山楂叶总黄酮的浸提效果的依据。2.2提取率的测定称取山楂叶粉末15.0g置于三口烧瓶中,加入300mL蒸馏水,分别预浸泡不同的时间(0、2、4、6、8h),然后加热微沸提取90min。待烧瓶冷却至室温后,离心分离收集上清液,测量其体积。准确量取5.0mL上清液于50mL烧杯中,加入60%乙醇20mL除杂,离心分离收集上清液并定容至100mL,按照1.2.3的方法测定其吸光度,根据提取液中总黄酮的含量计算其提取率。结果如图1所示。从图1试验结果看出,预浸泡时间对总黄酮的提取率的影响不大,在预浸泡时间为2h时,浸提可以达到比较好的效果。超过2h后随着时间的延长,总黄酮得提取率反而减少。2.3提取率的测定称取山楂叶粉末15.0g置于三口烧瓶中,分别按照不同的料液比(1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL)加入蒸馏水,预浸泡2h。然后加热微沸提取90min。待烧瓶冷却至室温后,离心分离收集上清液,测量其体积。准确量取5.0mL上清液于50mL烧杯中,加入60%乙醇20mL除杂,离心分离收集上清液并定容至100mL,按照1.2.3的方法测定其吸光度,根据提取液中总黄酮的含量计算其提取率。结果如图2所示。由图2可知,料液比对总黄酮的提取率有显著影响,随着溶剂水添加量的增加,总黄酮的提取率逐渐增大,当料液比达到1∶20时,浸提可以达到比较好的效果。再增加提取溶剂的量对提取率增加效果不大,考虑到生产成本,料液比以1∶20为宜。2.4提取率的测定称取山楂叶粉末15.0g置于三口烧瓶中,加入300mL蒸馏水,预浸泡2h。然后加热微沸提取不同的时间(20、40、60、90、120、150min)。待烧瓶冷却至室温后,离心分离收集上清液,测量其体积。准确量取5.0mL上清液于50mL烧杯中,加入60%乙醇20mL除杂,离心分离收集上清液并定容至100mL,按照1.2.3的方法测定其吸光度,根据提取液中总黄酮的含量计算其提取率。结果如图3所示。由图3可知,浸提时间对总黄酮的提取率有显著影响,随着浸提时间的增加,总黄酮的提取率逐渐增大,当浸提时间为120min时,就可以达到比较好的效果,尽管浸提时间为150min的提取率稍有提高,但考虑到实际生产应用中的生产周期及生产成本,确定浸提时间为120min较为适宜。2.5提取率的测定称取山楂叶粉末15.0g置于三口烧瓶中,加入300mL蒸馏水,预浸泡2h。然后加热微沸提取90min。待烧瓶冷却至室温后,离心分离收集上清液,测量其体积。将第1次浸提后的残渣转移到三口烧瓶中,加入300mL蒸馏水,重复提取1次,测量第2次提取液的体积。继续重复提取2次,测量各次提取液的体积。分别准确量取5.0mL第1次、第2次、第3次和第4次浸提液于烧杯中,各加入60%乙醇20mL除杂,离心分离收集上清液并定容至100mL,按照1.2.3的方法测定其吸光度,根据提取液中总黄酮的含量计算其提取率。结果如图4所示。由图4可知,浸提第1次和第2次后就可达到比较高的提取率,尽管第3次、第4次浸提后的提取率可以稍有提高,但考虑到实际生产应用中的生产周期及生产成本,因此浸提次数确定2次较合适。2.6山楂叶总黄酮最佳提取条件的确定为了全面考察影响因素,设计了四因素三水平正交试验,各试验因素水平见表1,试验结果见表2。从表2试验结果可以看出,极差分析为C>A>B,即提取次数>料液比>浸提时间,水浸提法提取山楂叶总黄酮的最佳条件为A2B2C2,即料液比为1∶20g/mL,浸提时间为120min,提取次数2次。在此条件下进行验证试验3次,得山楂叶总黄酮的提取率平均值为87.2%。2.7精制品总黄酮、总黄酮的分离纯化D101型大孔吸附树脂对山楂叶总黄酮的动态吸附和解吸性能及重复使用稳定性试验结果见表3。由表3数据可知,D101型大孔吸附树脂重复使用5次前的总黄酮吸附率都在80%以上,用70%乙醇洗脱时总黄酮解吸率都大于85%,精制品的纯度大于80%。从第6次开始总黄酮吸附率明显下降,其纯度也小于80%,需要再生才可继续使用,所以D101大孔吸附树脂只适宜重复使用5次。2.8山楂叶黄酮精制品的制备称取山楂叶粉末15.0g,按照以上所筛选的最佳水浸提工艺进行提取,经减压浓缩、ZTC-II澄清剂吸附澄清、D101大孔吸附树脂柱吸附、70%乙醇洗脱,将所收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇,经真空冷冻干燥后,再真空干燥至恒重,得山楂叶总黄酮精制品0.29g(3次试验结果平均值),得率为1.9%。按1.2.3项操作测定总黄酮含量0.24g,纯度82.8%。3山楂叶总黄酮的提取采用水浸提法进行山楂叶总黄酮的提取,具有投资设备成本低、能耗低、操作方