pen、p-ak和p-erk在胆脂瘤中的表达及其相关性

pen、p-ak和p-erk在胆脂瘤中的表达及其相关性

中耳胆脂瘤（midleaf）是耳科领域最受关注的常见疾病。它的特点是青少年听力疾病，那里有高度克隆鳞状上皮和邻近骨骼的破坏。目前对胆脂瘤的研究集中在上皮细胞增殖与凋亡的分子生物学水平这两个方面。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen,PTEN)是一种新的肿瘤抑制基因,随着研究的深入,人们对其作用的认识也发生了很大改变。过去认为PTEN绝大多数在细胞质,现在发现细胞质和核中都存在;过去认为PTEN的作用是单一的,现在发现PTEN蛋白的亚细胞定位不同,其作用也不尽相同〔１－２〕。目前还没有对中耳胆脂瘤中不同定位PTEN的研究。本文应用免疫组织化学SABC法和Westernblot免疫印迹法,定位、定量检测中耳胆脂瘤及正常皮肤中PTEN、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)和磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)的表达,分析它们之间的相关性,探讨其在中耳胆脂瘤形成机制中所起的作用,从细胞增殖和凋亡两个方面解释中耳胆脂瘤的发生发展。1皮肤损伤的皮肤组收集2011-01-2011-09在中国医科大学附属盛京医院耳科手术的中耳胆脂瘤标本40例,同时收集耳廓肿物切除术安全缘处皮肤或修补术中废弃及不能使用的耳后正常皮肤碎块15例作为对照组。用其中20例中耳胆脂瘤标本和10例正常皮肤标本行Westernblot免疫印迹法检测。1.2免疫印迹法检测免疫反应中表达阳性样品及检测结果评判1.2.1免疫组织化学实验所取标本于手术后立即甲醛固定。常规石蜡包埋,作4μm厚的连续切片,经两名有经验的病理医师阅片证实无误。每个标本切片3张,进行免疫组织化学染色,操作步骤严格按照SABC试剂盒说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。本实验主要采用北京中杉金桥生物技术有限公司提供的试剂盒,主要染色步骤如下:1将石蜡切片植入60℃烤箱1h;2二甲苯脱蜡两次,每次20min;3无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇下行梯度乙醇水化,各5min;4蒸馏水冲洗,PBS液中浸泡5min;53%过氧化氢去离子水孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗3次,每次3min;6抗原修复,采取胃蛋白酶行酶修复法行抗原修复20min,之后PBS冲洗3次,每次3min;7滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温孵育10min,倾去,勿洗;8滴加适当比例的一抗,4℃冰箱内过夜;9PBS冲洗3次,每次3min;10滴加试剂B(生物素化二抗工作液),室温或37℃孵育10~15min,PBS冲洗3次,每次3min;11滴加试剂C辣根酶标记链霉卵白素工作液),室温或37℃孵育10~15min,PBS冲洗3次,每次3min;12滴加新鲜配制的DAB显色液,在显微镜下控制背景,显色约3min左右;13用自来水充分冲洗,苏木精复染半分钟,蒸馏水冲洗,自来水返蓝30min;14行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;15观察和照相,100倍、200倍及400倍显微镜下观察显色情况并照相,每张片在400倍显微镜下随机取5个不重叠视野进行阳性细胞计数,计算阳性细胞所占比例。上述步骤中用己知阳性切片作为阳性对照,用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,以排除非特异性着色。结果评判标准:将胆脂瘤上皮和正常皮肤上皮层分为基底层(basallayer)、基底上细胞层(suprabasallayer)和表层即角质层(upperlayer)。细胞核或胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。在阳性细胞标准基础上,综合染色强度及阳性细胞数两个方面进行分析。1先按染色强度计分:0分为没有染色,1分为微弱棕黄色,2分为中等强度棕黄色,3分为深棕色;2然后每张400倍显微镜下随机选取5个不重叠视野进行阳性细胞计数,每个视野计数200个细胞,计算5个视野的阳性细胞的平均百分比,按照百分比计分:没有细胞着色为0分,<20%细胞着色为1分,21%~50%细胞着色为2分,>50%细胞着色为3分;3最后将染色强度计分和百分比计分相乘之积作为该样本评判标准,得分为0~2分者为阴性样本(-),3分或以上者为阳性样本(+)。1.2.2Westernblot免疫印迹法检测各个目的蛋白的表达1提取蛋白方法:将少量组织块(100mg左右)置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加400μl单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆,然后置于冰上。几分钟后再碾一会儿再置于冰上,重复碾几次使组织尽量碾碎。裂解30min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000r/min离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。用时取出,直接溶解上样。2电泳:根据目的蛋白的分子量,配制10%SDS胶垂直电泳,根据蛋白浓度调整上样量,保持每孔40μg蛋白上样,先采用电压90V,1h浓缩样品蛋白,再采用电压120V,90min电泳分离样品蛋白。3转膜:电泳结束后,PVDF膜先后要在100%甲醇里浸泡10min、去离子水中浸泡20min,接着将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜一起放在转膜缓冲液中浸泡10min,按照“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”依次顺序装好转膜装置(膜靠正电极一边),按恒压100V电转移120min到PVDF膜上。4封闭和一抗孵育:用5%脱脂奶粉常温下封闭摇床1h,PBS液洗膜3次,每次15min,然后加入按说明书要求稀释的PTEN、P-AKT、P-ERK和内参GAPDH抗体,于4℃孵育过夜。5二抗孵育:TBST液洗膜3次,每次15min,加入二抗,室温下摇床1h。6显影:TBST液洗膜3次,每次15min,用ECL显色液显色,定影液终止显色。7各实验重复3次。1.3异比较及计量资料的比较应用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计学处理,计数资料的差异比较采用χ２检验,计量资料的差异比较用两样本t检验,运用Spearman检验来判断PTEN、P-AKT和P-ERK蛋白表达之间的相互关系(相关性分析),以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1中耳胆脂瘤p-akt表达情况核PTEN在胆脂瘤和正常皮肤的上皮层细胞核着色,以基底层和基底上细胞层为主。15例正常皮肤中10例为阳性标本(图1);40例中耳胆脂瘤标本中有11例为阳性标本(图2)。PBS缓冲液代替一抗的阴性对照片不着色。中耳胆脂瘤标本阳性率为27.5%,正常皮肤阳性率为66.7%,两者差异具有统计学意义(P<0.01);质PTEN在胆脂瘤和正常皮肤的上皮层细胞质着色,以基底层和基底上细胞层为主。15例正常皮肤中13例为阳性标本(图1);40例中耳胆脂瘤标本中有21例为阳性标本(图2)。PBS缓冲液代替一抗的阴性对照片不着色。中耳胆脂瘤标本阳性率为52.5%,正常皮肤阳性率为86.6%,两者差异具有统计学意义(P<0.01);P-AKT在胆脂瘤和正常皮肤的上皮基底层和基底上细胞层胞质中着色,有时亦伴有胞核着色。15例正常皮肤中有4例为阳性标本(图3),阳性率为26.7%,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。40例中耳胆脂瘤标本中有29例为阳性标本(图4),阳性率为72.5%;P-ERK染色主要位于细胞核,15例正常皮肤中有4例为阳性标本(图5),阳性率为26.6%;40例中耳胆脂瘤标本中有33例为阳性标本(图6),阳性率为82.5%,分布于胆脂瘤上皮全层,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。PTEN,P-AKT和P-ERK蛋白表达相关性检验采用Spearman相关分析得出,中耳胆脂瘤中质PTEN与P-AKT蛋白阳性表达之间呈显著负相关(r=0.558,P<0.01);核PTEN与P-ERK蛋白阳性表达之间呈显著负相关(r=-0.569,P<0.01)。Westernblot免疫印迹法显示:PTEN蛋白在中耳胆脂瘤细胞中的表达明显少于正常皮肤,P-ERK、P-AKT在中耳胆脂瘤细胞中的表达明显多于正常皮肤(图7)。本实验重复3次。三种蛋白在中耳胆脂瘤与正常皮肤的相对灰度值行两样本t检验,差异有统计学意义(表1)。3pten的功能目前人们对胆脂瘤发病机制进行了大量的研究,主要集中在上皮细胞过度增殖、细胞凋亡和骨质破坏吸收等方面,但其发病机制至今尚未明确。首先明确两个概念:细胞增殖(cellproliferation)是通过细胞分裂增加细胞数量的过程;细胞凋亡(ap-optosis)又称细胞程序性死亡(programmedcelldeath),是由基因调控引发的,细胞在一定的生理或病理条件下遵循自身的程序,自我结束生命的死亡方式。可见,细胞增殖与细胞抗凋亡不是一个意思,所以之前有一些学者认为细胞凋亡受到抑制就是促进增殖或细胞增殖受抑制就是促进凋亡,缺乏进一步的解释。国内外对中耳胆脂瘤上皮的增殖与凋亡做了大量研究,目前普遍认为胆脂瘤囊壁的复层鳞状上皮高度增殖与胆脂瘤的发生发展密切相关,但具体的机制还未完全清楚。而关于胆脂瘤上皮细胞的凋亡研究,学者们的意见并不一致。目前有两种不同观点:其一认为胆脂瘤上皮细胞凋亡增强〔３－４〕,另一认为胆脂瘤上皮细胞凋亡受抑制〔５－６〕,即抗凋亡(antiapoptosis)。本实验从细胞增殖和凋亡两个方面研究PTEN及其下游蛋白在中耳胆脂瘤形成过程中所起的作用,期望有助于解释中耳胆脂瘤的发病机制,为其预防和治疗提供理论依据。PTEN是最早发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因,能够维持正常的物质代谢和内环境自稳态,大量研究证实:PTEN基因在多条信号通路的负调控中发挥重要作用,影响靶分子及其下游的信号级联反应,调节细胞的多种生理活动。最早对PTEN的研究多报道PTEN位于胞质中,而后大量研究表明PTEN不仅存在于胞质还存在于胞核中,因为早期研究多集中在肿瘤细胞,而大多数肿瘤细胞中核PTEN都是缺失的〔７－８〕。之后许多实验〔８－９〕证明,在正常的静态组织中PTEN主要定位在细胞核。随着PTEN蛋白胞核胞质穿梭现象的发现〔１０－１１〕,越来越多的人认为核PTEN与质PTEN的作用不尽相同〔２〕。核PTEN承担抑制细胞增殖的功能〔１０－１２〕。有报道显示核PTEN可以抑制ERK激活,从而对ERK信号途径起负调节作用〔１３〕。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)家族成员之一,是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要成分,磷酸化的ERK由胞质向胞核传递,参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂、死亡等多种生理过程,并在细胞的恶性转化中起重要作用〔１４〕。ERK信号转导通路至少通过3条途径调节细胞的增殖〔１５〕,即通过磷酸化氨甲酰基磷酸合成酶Ⅱ激发DNA合成;通过MAPK活化的蛋白激酶促进细胞周期的进展;通过增强转录因子AP-1的活性间接促进细胞的生长。MAPK在细胞周期中还可能是调节微管组织中心(microtubuleorganizingcenters,MTOC),因为在转位期MAPK可被激活并且与MTOC相关活化的ERK1/2在M期与MTOC结合,调节MTOC的功能。在G1/S转变期,活化的ERK1/2能通过FOS家族和myc诱导cyclinD1的表达,同时调节cyclin/CDK复合物的形成;在G2/M转变期,活化的ERK1/2参与了cy-clinB1转运入胞核。通过上述途径,ERK1/2信号转导通路促进细胞周期进展,最终导致细胞恶性增殖〔１６-１７〕。而提到质PTEN的功能,过去研究者发现PTEN绝大多数在细胞质中,自从发现细胞核也存在PTEN蛋白后,人们才有意识地区分核质PTEN的不同作用。所以之前对PTEN的研究结果不能笼统地认为就是质PTEN的作用。目前认为质PTEN最主要的功能就是下调PI3K/AKT通路和上调〔p27Kip11〕。相关报道显示细胞的P-AKT蛋白水平下降与增加该细胞中表达野生型PTEN蛋白密切相关。PTEN能使PIP3脱磷酸,来维持PIP3的低水平,从而下调PI3K/AKT通路。PTEN的失活必然导致PI3K/AKT通路活化〔18〕,活化的AKT是细胞存活因子,能通过多种途径降低凋亡因子与增加抗凋亡蛋白的活性〔11,19〕。至今国内外对PTEN/ERK通路在中耳胆脂瘤所起的作用研究甚少,Huisman等〔２０－２１〕利用免疫组织化学方法检测出P-ERK在中耳胆脂瘤中的表达明显多于正常皮肤组织,但并没有检测PTEN的表达变化;而对PTEN/AKT通路在中耳胆脂瘤所起的作用研究不多,Yune等〔２２〕利用免疫组织化学方法检测出P-AKT在中耳胆脂瘤中的表达明显高于正常皮肤组织,并检测胆脂瘤中PTEN的表达低于正常皮肤组织,两者呈负相关。但没有进一步分析与核、质PTEN的相关性。本实验利用不同亚细胞定位的PTEN功能不同这一特点,从细胞增殖和凋亡两个方面研究PTEN及其下游蛋白在中耳胆脂瘤形成过程中所起的作用。结果表明中耳胆脂瘤中总PTEN蛋白(核PTEN加质PTEN)的表达量少于正常皮肤中总PTEN蛋白的表达,其中核PTEN、质PTEN的表达也分别少于