木霉防治植物立枯病的初步研究

木霉防治植物立枯病的初步研究

定向育苗病是指在育苗阶段由各种真菌引起的土壤传播疾病，发生在不同的地区，危害严重，难以控制。多年的化学预防使细菌对各种杀菌剂和土壤消毒剂产生了抗药性，抗药性发展速度惊人，导致化学农药的使用剂量增加，农药残留增加，土壤生物结构受到破坏。因此,相对安全的生物防治越来越引起人们的关注。木霉(Trichoderma)作为最重要的生物防治因子在国内外被广泛研究,用木霉制剂防治植物病害具有对人畜无毒、产品无农药残留、不污染环境等优点,木霉不仅对植物病原真菌具有拮抗效应,还能促进植物营养吸收、提高植物生长和生物量。目前,应用木霉菌剂在林业、药用植物、农业以及花卉病害的生物防治中均取得了显著效果,并且世界上有多种木霉商品化菌剂问世,在生物防治药剂市场占据重要地位。本研究对从以色列耶路撒冷希伯来大学农学院引进的6株木霉菌株进行了筛选,将高效菌株制备生物菌剂对针叶苗木立枯病进行了室外防治试验。1材料和方法1.1高效木霉菌株的引进供试木霉(Trichoderma)菌株8株,其中T-13、T-19、T-43、T-35、T-28、T-203为从以色列引进高效菌株,T-C14、T-C33为东北林业大学森林微生物实验室保存的高效菌株,具体菌株信息见表1。苗木立枯病病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、腐皮镰刀菌(Fusariumoxysporum),东北林业大学森林微生物实验室保存。1.2竞争系数及抑菌率测定采用平板对峙培养法,每个处理3次重复。在25℃恒温培养箱中培养,每8h测量1次菌落直径,测量48h,计算抑菌率、生长速度及相对抑制效果,并对对峙拮抗线进行观察和描述,统计竞争系数,每个处理3次重复。对峙培养中竞争系数分级标准:Ⅰ级.木霉菌丝占据平板100%;Ⅱ级.木霉菌丝占据平板2/3以上;Ⅲ级.木霉菌丝占据平板1/3~2/3;Ⅳ级.木霉菌丝占据平板1/3以下;Ⅴ级.病原菌菌丝占据平板100%。记录48h后病原菌和木霉菌菌落之间的关系。抑菌率=[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]×100%。相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。1.3生长抑制率测定非挥发性代谢产物的制备:将木霉菌株接种到PDA平板上活化3d,用0.5cm打孔器取3片菌饼,接种到300mLPD培养基中,25℃,150r/min,恒温振荡培养7d,用8层纱布过滤菌丝,制成木霉发酵液原液,减压旋转蒸发将发酵液浓缩到原体积的1/10,备用。抑菌活性测定:采用菌丝生长抑制法,将制备好的非挥发性代谢产物添加到PDA培养基中,摇晃均匀,使终浓度达到20%,倒平板,待冷却凝固后,接入病原菌,以不添加代谢产物的PDA平板作对照,25℃恒温培养5d,采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径,计算木霉非挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率,每个处理3次重复。抑菌率=[(对照菌落半径-抑制培养菌落半径)/对照菌落半径]×100%。1.4生长抑制率测定采用对扣培养法测定,将木霉在90mm平皿上培养2d后,去掉皿盖,扣上接有病原菌菌片的平皿,放入25℃恒温培养箱中,倒置培养。以仅接种病原菌的培养皿为对照。每天观察病原菌和木霉菌丝的生长状况,对扣培养5d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径,计算木霉挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率,每个处理3次重复。抑菌率=[(对照菌落半径-抑制培养菌落半径)/对照菌落半径]×100%。1.5制备菌种、培养基、灌根经过高效菌株筛选,选择T-43制备生防菌剂进行室外防治红松、落叶松和云杉的一年生苗木立枯病,同时以T-C14作为对照。其中,红松、落叶松防治在黑龙江省苇河林业局西林苗圃进行,云杉防治在黑龙江省带岭林业局西苗圃进行,防治时间为2011年5月5日和25日分2次进行。菌剂制备方法:孢子悬浮剂,将木霉菌株接种到PDA平板上,25℃恒温培养7d,用无菌水冲洗孢子,用血球计数板计算浓度,稀释制备3.5×109个/mL,4℃保存备用;液体菌剂,将木霉菌株接种到PDA平板上,25℃恒温培养5d,用无菌水冲洗孢子,制备成104个/mL备用。制备PD培养基,121℃灭菌20min,冷却后接入木霉孢子液1mL,25℃恒温振荡培养7d,4℃保存备用。防治方法:采用灌根法,将2种菌剂分别设置4个浓度梯度,共16个处理,同时以空白(清水)、多菌灵(50%可湿性粉剂)800倍以及牛博士1000倍(木霉孢子可湿性粉剂)作为对照,共计19个处理,分别浇灌到一年生苗根部,每个处理2次重复,连续防治2次。防治效果调查:30d后测定苗木的生长量(苗高、根长、全株高)、生物量(湿重、干重),并调查发病率,计算防治效果,使用SPSS软件计算显著性差异。2结果与分析2.1对腐皮刀菌的抑制率平板对峙培养结果表明,不同木霉菌株对丝核菌和镰刀菌的拮抗作用差异明显,对丝核菌相对抑制率较高的为T-13和T-43(表1),相对抑制效果分别为3.3和2.7,对腐皮镰刀菌的相对抑制率均约为1。在对峙培养中,木霉菌可有效抑制病原菌的生长,形成明显拮抗线,其中T-13、T-19菌丝可以越过病原菌继续生长,直至完全覆盖病原菌菌落,而T-43、T-28和T-C14在菌落交接处形成颜色较深的拮抗线,病原菌菌丝生长稀疏,T-203菌丝生长速度较慢,对丝核菌和镰刀菌的拮抗效果较弱,对病原菌菌丝生长的抑制作用不明显。2.2木霉代谢产物的抑菌活性木霉的生防作用包括竞争作用、重寄生作用、产生抑菌活性成分。木霉可产生多种次生代谢产物,其中包括抑菌活性成分,可以抑制其他真菌的生长,通过混合培养基法和对扣培养法分别测定了木霉的非挥发和挥发性代谢产物对立枯丝核菌和腐皮镰刀菌生长的抑制作用(表2)。试验结果表明,代谢产物抑菌作用明显的菌株有T-43、T-13和T-C14,对丝核菌和镰刀菌的抑制率均>70%,其中T-43代谢产物的热稳定性较好,灭菌处理后,仍然具有很高的抑菌活性,病原菌在含有活性成分的培养基上菌丝生长稀疏,气生菌丝较多。挥发性代谢产物抑菌率普遍偏低,其中对丝核菌生长几乎没有抑制作用。2.3室外育苗和繁殖试验2.3.1木霉菌剂防治效果木霉作为世界公认的高效生防菌株,在防治土传病害中作用明显,并且在农业生产中已经得到推广应用,并推出多种木霉商品化菌剂,在林业苗圃中应用研究还处于空白状态,本研究通过灌根防治立枯病,二次防治30d后,木霉菌剂对立枯病具有明显的防治效果(表3),不同浓度菌剂处理防治效果差异显著,对于落叶松苗木,T-C14+T-43的孢子菌剂30倍液处理防治效果达到88.6%,仅次于化学药剂多菌灵800倍液处理;对于红松苗木,单独使用T-43孢子菌剂1倍液、10倍液和30倍液灌根处理,可以达到80%以上的防治效果;对云杉,单独使用T-43孢子菌剂30倍液灌根处理,防治效果最高,到88.63%。总体评价,引进菌株T-43在室外立枯病防治试验中表现良好,可以在土壤中迅速定植,并表现出较高的病害控制能力。2.3.2木霉剂处理对苗木生长和抗逆性的影响木霉可以代谢出多种生长素类物质,对促进植株生长具有明显的促进作用。本试验结果表明,木霉灌根30d后,对3种针叶苗木均有显著的促生作用,植株高、生物量等指标均明显增加(图1~3)。与孢子悬浮液相比,液体菌剂在促生作用方面更具优势,其中10倍液、30倍液处理,苗木长势最好,在株高生长上,与对照相比,木霉菌剂处理30d后,苗木可以增加15%的生长量,湿重和干重的生物量约增加80%。同样株高的苗木,更加粗壮,抗病和抗逆能力更强,50倍液与对照差异不显著,而1倍液处理,由于浓度过高,对植株的生长会起到副作用。木霉对植物具有促生抗逆的作用,有研究证明,木霉在促进植物生长和生物量增加的基础上,还可以诱导植物产生抗逆性,增加红松和落叶松苗木的总蛋白含量,提高保护酶活性,增加植株的抗逆性,同时增加针叶中的叶绿素含量,对促进光合作用明显,使一年生苗的生物量增加。与商品化木霉菌剂相比,引进木霉菌株T-43优势明显,在有效防治立枯病的同时,显著增加松苗的生物量和株高生长,具有开发木霉菌剂的优势和潜力。3皮镰菌的抗性1)通过平板对峙培养和代谢产物抑菌试验综合筛选得到可以有效抑制立枯丝核菌和腐皮镰刀菌的高效木霉菌株T-43和T-C14,在对峙培养中,这2种菌株可有效抑制病原菌的生长,形成明显拮抗线,并最终覆盖病原菌菌落,病原菌在含有木霉代谢产物的培养基上不生长或生长菌落稀疏,气生菌丝较多,生长受到抑制明显。2)对立枯病防治的田间试验中,孢子粉剂和液体菌剂均可以有效地控制多种针叶苗木落叶松、红松和云杉立枯病的发生,其中T-43孢子菌剂防治效果好于液体菌剂,在促进植株生长方面,液体菌剂效果明显。本试验结果表明,木霉菌株T-43和T-C14对立枯丝核菌和腐皮镰刀菌具有较强的拮抗作用,其代谢的抑菌活性物质可以有效抑制病原菌的生长,笔者另外的试验结果证明,这2种木霉菌对其他林木病原菌包括杨树烂皮病菌(Cytosporachrysosperma)、松枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)、沙棘干缩病菌(Fusariumsporotrichioides)、松烂皮病菌(Cenangiumferruginosum)同时具有明显的拮抗作用,说明这2种木霉菌都是适应性较强的广谱性拮抗真菌,在林木病害生物防治中具有广阔的开发应用前景。木霉菌作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物,在植病生防中具有不可替代的地位,目前对木霉菌的筛选、应用研究在各种病害防治中都有相关的研究,并取得了显著的效果,本试验中对木霉代谢产物的抑菌活性物质的分离纯化有待进一步研究。木霉菌是重要的生防真菌,研究发现部分木霉菌株可定殖于植物根际,与植物根系形成共生体,改变植物的代谢功能,表现在促进植物生长、增加养分吸收利用效率、提高农作物产量以及诱导植物产生抗逆性等方面。木霉菌对植物的促生作用包括增加种子萌发率、促进出苗、提高根系和茎叶生物量等,如黄瓜接种T.harzianum后,可以增加95%的根系面积并提高根系对微量元素的富集水平。Gravel使用深绿木霉处理番茄,使茎叶和根的干质量增加3倍,并且显著提高了产量。目前,关于木霉促生作用的研究对象主要