生防菌对人参锈腐病菌的抑菌效果

生防菌对人参锈腐病菌的抑菌效果

人参腐败是人参最常见的疾病之一。据统计，目前中国的平均发病率为20%30%。长期以来人们一直使用有毒物质对土壤进行处理或使用高毒化学农药进行防治,效果不理想,且易造成参地污染和农药残留等问题,导致人参品质下降,甚至出现因农药超标而限制出口,大大制约了人参产业的发展。国家GAP标准规定,在药用植物病害防治上,要求使用广谱、低毒、低残留的药剂,提倡使用生防制剂。人参根际土壤中存在着大量具拮抗活性的有益微生物,利用这些拮抗微生物对人参土传病害进行生物防治,能够改善人参根际微生态环境,具有无毒,无污染等优点,是防治人参土传病害的一条有效途径。目前,人参锈腐病生防菌资源的开发研究基础较为薄弱,特别是对于人参锈腐病生防细菌和多菌株混用资源的相关报道较少。本试验从吉林和辽宁不同人参生态区根际土壤中分离拮抗微生物,以人参锈腐病菌为靶标菌进行筛选,并对具有较好拮抗活性的菌株进行鉴定,为能够从生物防治角度防治人参根部病害奠定理论基础。1材料和方法1.1细菌病原菌保鲜供试菌株为人参锈腐病菌(Cylindrocarpondestructans)、人参菌核病菌(Sclerotiniaschinseng)、人参立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、人参根腐病菌(Fusariumsolani)和人参黑斑病菌(Alternariapanax),由沈阳农业大学药用植物病害研究室保存。1.2主要人参种植区的土样2007~2008年分别从吉林抚松、集安,辽宁宽甸、新宾和清原等主要人参种植区采集根际土壤,共采集土样164份。采用稀释分离法对土样中生防菌进行分离纯化,共得到细菌1026株,木霉菌79株。1.3生防木霉菌筛选以人参锈腐病菌为靶标菌进行拮抗活性测定。生防细菌筛选采用抑菌圈法。将配制好的菌悬液与PDA培养基混合后制成平板,将供试生防菌转接于PDA平板上,20℃恒温培养5d后测量抑菌圈直径,每处理重复3次。生防木霉菌筛选采用对峙培养法。用直径为5mm的打孔器自培养5d的供试木霉菌株和人参锈腐菌菌落边缘打取菌片,分别移置平板两侧,20℃恒温培养5d后测量菌落直径,以人参锈腐菌单独培养为对照,每处理重复3次。1.4抗木霉菌系统发育分析拮抗细菌鉴定采用形态特征、生理生化和16SrDNA基因序列测定相结合的方法。形态特征和生理生化特性试验参照《常见细菌系统鉴定手册》和《一般细菌常用鉴定方法》。细菌总DNA的提取参照李德葆等方法,PCR扩增采用以下引物P1:(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)P2:(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’),PCR反应体系(50μL)为:buffer(10×)5.0μL,dNTP(10mM)1.0μL,P1:(10μM)1.0μL,P2:(10μΜ)1.0μL,TaqPolymerase(2.5U/μL)0.5μL,Mg2+(25mM)3.0μL,DNA1.0μL,加超纯水至50μL。PCR扩增条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,57℃退火45s,72℃延伸2min循环35次,72℃延伸10min。测序由北京华大基因公司完成。将测序结果与GenBank中核酸数据进行Blast比对,选取同源性高的菌株序列利用ClustalX、BioEdit、MEGA4.0软件进行系统发育分析。拮抗木霉菌株鉴定采用形态学鉴定。将待鉴定的菌株置于25℃下培养,在菌落成熟时对菌落形态进行观察,并挑取菌丝、孢子制片,观察孢子大小、形态颜色,同时将孢子接种于涂有SNA培养基的载片上,置于培养皿内培养。待长出分生孢子梗时,观察记录分生孢子梗的形态特征,参照文成敬的研究结果进行分类鉴定。1.5数据的统计分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,各试验处理中均采用平均值。2结果与分析2.1不同菌种对人参锈腐病的抗菌活性检测对从吉林、辽宁不同人参生态区根际土壤中分离得到1026株细菌,79株木霉菌进行室内拮抗活性测定,初筛结果发现BS015等10株细菌(图1),Tri41等9株木霉菌(图2)对人参锈腐病具有较好的拮抗活性。其中菌株BS015和HN01对人参锈腐病菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为22.8mm和21.9mm(图3,图4)。测定结果表明,当供试木霉菌与人参锈腐病菌接触后,人参锈腐病菌菌落停止生长,而各供试木霉菌均可不同程度的继续生长,以Tri41、Tri43、Tri42和Tri09抑菌效果最好,抑菌率分别为76.6%,74.4%,74.3%和72.6%。其中Tri41菌株菌落生长速度最快,产孢量最大,颜色墨绿,抑菌效果最佳(图5,图6),故选取该菌株进行后续研究。2.2人参指征菌种的筛选由表1可见,拮抗菌株BS015、HN01和Tri41不仅对人参锈腐病菌具有很好的拮抗活性,且对人参的菌核病菌、根腐病菌、黑斑病菌、立枯病菌4种人参常见病菌也具有较好的拮抗活性,说明3株拮抗菌株有很好的广谱抗性,具有较好的研发价值。2.3抗菌、芽孢杆菌生长拮抗细菌BS015在NA和PDA培养基上生长良好,菌落圆形至不规则形,灰白色,中间褶皱(图7)。革兰氏染色阳性,菌体为杆状,营养体大小为(0.6~0.8)μm×(1.7~2.8)μm,有芽孢、椭圆形、中生,周生鞭毛。拮抗细菌HNO1在NA及PDA培养基上生长良好,菌落乳白色、脓状、圆形、边缘整齐、菌落隆起呈馒头状、表面湿润粘稠(图8);革兰氏染色阳性,菌体为杆状,有芽孢、椭圆形,周生鞭毛。初步鉴定菌株BS015为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),HN01为多粘芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。菌株生理生化指标及结果见表2。2.4bs-ss1系统发育树构建拮抗细菌16SrRNA基因测序(由北京华大基因公司完成)结果与NCBI数据库进行相似性比对,利用ClustalX、BioEdit、MEGA4.0软件构建系统发育树。对比结果表明,菌株BS015的遗传进化距离与已知菌株Bacillussubtilis(GQ199598)最近(图9),同源性为99%,HN01的遗传进化距离与已知菌株Paenibacilluspolymyxa(AY359622)最近(图10),同源性为99%。结合菌株形态特征和生理生化鉴定结果,鉴定菌株BS015为枯草芽孢杆菌,HN01为多粘芽孢杆菌。2.5瓶梗安培养法菌株Tri41在PDA上生长迅速,菌落老熟时表面暗绿色,反面同色。主分枝呈树状,多级对生或轮生分枝,稀单生;瓶梗安培状到近球形,基部变细,中间膨大,较直,常3~4个轮生,或两个对生,有时单个生于孢子梗上,分生孢子近球形或倒卵形,灰绿色,壁光滑,约3.0μm×3.5μm。初步鉴定Tri41为哈茨木霉(Trichdermaharzianum)。3不同人参生态区根际土壤菌群的分离与鉴定人参种植年限较长,易造成土传性病原物的积累,有益微生物种群减少,从而形成了特殊的根际微生态环境,导致根部病害发生为害严重。筛选、开发和引入拮抗微生物能够从本质上改善人参根际的微生态环境,从而达到控制病害的目的,既符合人参GAP栽培标准,又保障了人参的品质。对从吉林、辽宁不同人参生态区根际土壤中分离得到1026株细菌,79株木霉菌以人参锈腐病菌为靶标菌进行了拮抗菌株的筛选,发现3株具有较好拮抗活性的菌株,其中菌株BS015和菌株HN01为细菌,抑菌圈直径分别为22.8mm和21.9mm。菌株Tri41为木霉菌,抑菌率高达76.6%。结合16SrDNA分子鉴定和形态鉴定对3株菌株进行了鉴定,结果表明菌株BS015为