绿色木霉v36发酵液体抗生代谢物的研究

绿色木霉v36发酵液体抗生代谢物的研究

油菜机是中国的主要油食机。近年来，种植面积约700万辆hm。菌核病的严重发生对我国油料的可持续发展构成了威胁。油菜菌核病生物防治不仅具有与生态环境保护和可持续发展要求一致的优点,而且可操作性强,防治效果好。因此生物防治正在成为油菜菌核病的关键防治技术,倍受人们青睐。绿色木霉(Trichodermaviride)是国内外研究较多的一种生防菌,关于其发酵和抗生代谢产物防治菌核病的研究以前都没有人作过详细报道,本文对此进行了初步研究。1材料和方法1.1ss/scliasclia模型绿色木霉Tv36来自本实验室。核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)SS从油菜田间采集菌核分离纯化。13种培养液及其成分见表1。1.2制备nd-pcr培养强、强的核盘菌水培养基11010将各种培养液调节pH至6.5,灭菌;用灭菌的0.1%Tween-80数毫升洗脱7日龄的Tv36(PDA培养基培养)平板表孢子,血球计数计检测孢子数,调配成4×106个孢子/ml的孢子悬浮液;每个250ml三角瓶中加一种培养液(80ml),并加入1ml孢子悬浮液,25℃下置于200r/min摇床中发酵7d,然后进行生物测定。其生测步骤如下:发酵液在4℃下,6000~8000r/min离心20min;将上清液用装有0.22μ滤膜的细菌滤器过滤,得到无菌滤液;将20mlPDA平板打一个直径为4mm的小孔,在小孔中加入50μl无菌滤液,1h以后,将生长一致的2日龄(直径为8mm)核盘菌琼脂菌丝圆片置于孔上,25℃下培养;2~3d后,调查菌落直径,计算抑菌率。以灭菌水为对照,每处理重复5次。1.3优化配置研究在1.2生测试验结果基础上,选择3种较优配方,以其成分为因子,设计正交试验,发酵,经生物测定确定最佳配方。1.4最佳发酵滤液用量试验设OTF发酵原液及原液稀释5、10、20、50倍,以GPF发酵滤液、OTF培养液作参比对照,以灭菌水作空白对照,每处理设4次重复。试验方法与1.2生测方法相同。供试油菜品种为中油119,以最佳发酵滤液供试,设10、20、50倍稀释液及灭菌水等4个处理,每处理14片叶,喷液量约30ml,室温下保湿过夜。次日上午接种3日龄核盘菌菌丝圆片,每叶在主脉两侧各接种一片,盖塑料薄膜保湿,置于22℃光照培养室中,2日后调查接种点发病率、病斑直径,计算其保护效果和抑菌效果。1.5菌核净喷液量的确定供试油菜品种为8518,设Tv36农抗液剂20、50、100倍,50%菌核净1420倍,清水等5个处理,每处理设4次重复。小区面积23.2m2,随机区组排列,喷液量按1125kg/hm2计,各处理于盛花期喷雾一次。油菜成熟后调查菌核病发病情况。2结果与分析2.1不同培养液对核盘菌的抗菌活性Tv36经13种已知发酵培养液发酵后,以GPF、谷壳-麦麸培养液Ⅳ和配合饲料培养液3种培养液的发酵滤液对核盘菌的抑制作用最大,说明它们所产生的对核盘菌的抗菌物质较多或效价较高,3种培养液中又以GPF最佳(表1)。2.2最佳发酵滤液配方的确定以上述较优的3种配方的成分(葡萄糖,酒石酸铵,KH2PO4,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O,谷壳,麦麸)为因数,每因数根据其在原配方的用量情况,上下浮动一定范围,设3个水平,分别为:葡萄糖0、10、25g,酒石酸铵0、1、2g,KH2PO41、2、3g,MgSO4·7H2O0.5、1、1.5g,FeSO4·7H2O0.01、0.1、0.2g,谷壳0、20、40g,麦麸0、10、20g;另设发酵时间为因数,设4d和7d两个水平。采用L18(21*37)正交表设置处理。结果(表2)经统计分析,葡萄糖、酒石酸铵、KH2PO4、MgSO4·7H2O、麦麸因数各水平之间经F测验达极显著差异水平。而发酵时间,FeSO4·7H2O,谷壳三因数水平之间差异不显著。从而得到最佳发酵滤液配方OTF。在pH=6.5,200r/min,28℃下,发酵4d即可。2.3最佳配方Tv36发酵液及稀释液均有明显的离体抑菌效果,以原液、5及10倍稀释液效果较佳(表3)。3种不同稀释倍数的发酵液在离体叶试验中均有明显的抑制效果,以10、20倍两处理抑制作用最强,并能有效地保护油菜免受病原核盘菌侵染,接种点发病率很低(表4)。2.4tf农抗液剂对柴油菌核病效果及保产增收效果大田防病试验结果(表5)表明,Tv36-OTF农抗液剂对油菜菌核病防病效果及保产增产效果十分明显,以稀释20、50倍为佳,防病效果可达60%以上,增产达15%以上。3绿色木霉发酵滤液本文对绿色木霉产生抗生化合物进行了优化配方和对核盘菌的防治效果的研究。绿色木霉产生的抗真菌代谢物对核盘菌有较好的防治效果,稀释50倍以下时可达到60%以上。然而,绿色木霉发酵滤液的生产成本仍然较高,在目前条件下,其田间使用的稀释倍数以50倍