香山黄枯萎病菌的分离与鉴定

香山黄枯萎病菌的分离与鉴定

北京香山是中国著名的风景如画的地方。作为首都秋天的“著名风景”，每年吸引数百万名国内外游客。黄栌(Cotinuscoggygriavar.cinerea)是构成香山红叶景观的主体树种,其叶片秋季变红,色泽鲜艳,木材可提取黄色染料,并可制作家具或用于雕刻,树皮和叶可提制栲胶,枝叶入药有消炎、清热之功效,是一种综合利用价值极高的木本植物。枯萎病是香山红叶的主要病害,不仅严重影响红叶景观,甚至会导致植株枯萎死亡,而至今鲜有有效的防治方法,逐渐引起社会的广泛关注。某些丝状真菌是导致黄栌枯萎病的主要病原体,本研究进行了黄栌枯萎病叶的真菌分离与鉴定,希望为黄栌枯萎病的防治奠定微生物生态学基础。1组织分离和pcr检测1.1植物材料黄栌叶片于2013年8月采自北京香山公园平均3年树龄的黄栌植株(图1,见封四),具体位置为东经116.19°,北纬39.99°,海拔181m。采集样品于4℃条件下保存。1.2培养基及试剂玫瑰红钠和PDA成品培养基,购自北京陆桥公司;基因组DNA快速提取试剂盒及PCR相关试剂,购自TIANGEN公司;PCR引物,由上海生工生物工程有限公司合成。1.3枯萎病叶片寄生真菌的分离培养与形态学观察称取2g发病叶片,无菌水冲洗2次,用无菌剪刀剪碎叶片,于无菌研钵中加入少量灭菌的石英砂和碳酸钙及少量无菌水研磨,然后依次用无菌水稀释成浓度为10-1g/mL、10-2g/mL、10-3g/mL的组织悬液。分别取100μL悬液涂布于玫瑰红钠平板上(平板含有25mg/mL氯霉素和25mg/mL四环素),每个处理3个平行。玫瑰红钠平板置于25℃培养箱中培养,从第2天开始对平板上的单菌落进行分离计数,共7d,根据菌落形态(包括大小、形状、颜色、质地、有无渗透液,有无可溶性色素等),对可培养真菌进行初筛,利用PDA培养基平板纯化菌株。纯化好的菌株,利用试管保存备份,并提交给中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保存。1.4枯萎病叶片寄生真菌的分子生物学鉴定利用基因组DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA,采用通用引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增ITSrDNA序列,到种或属水平鉴定;Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG-C-3′)扩增微管蛋白基因序列,到种水平鉴定。PCR反应体系为:模板10×PCRbuffer5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、模板2μL、TaqDNA聚合酶1μL、引物各1μL,补充去离子水至50μL。反应条件:94℃5min;94℃50s,55℃50s,72℃50s,33个循环;72℃7min。PCR产物用1%凝胶电泳进行检测并送交上海生工生物工程有限公司测序。将序列信息提交至GenBank,获得序列登录号为KF746056—KF746064,并将测序结果在GenBank数据库中进行比对分析,以确定与已知序列的同源关系。采用CLUSTALX1.83进行多序列比对,并利用NJ法通过MEGA5.0软件进行系统发育树及分子进化分析。2菌体及真菌生物学特性2.1寄生真菌分离结果与形态观察真菌分离结果中未得到酵母菌株,共分离到霉菌22株,形态观察将其分为4类。菌株形态描述及其CICC编号见表1,形态照片见图2(见封四)。2.2寄生真菌分子生物学分析通过构建ITSrDNA系统发育树分析(见图3),4类霉菌隶属于4个属。ITSrDNA序列NCBI比对结果见表2。菌株HL6通过微管蛋白基因(β-tubulin)测序分析,Blast最高相似性种为Penicilliumoxalicum(KC344993)。3植物枯涣病叶主要增加植物的分离鉴定黄栌枯萎病严重影响香山红叶美景,甚至会造成树木枯亡,自20世纪80年代至今尚未实现有效防治。目前已有相关研究发现丝状真菌是植物枯萎病的主要致病因子[5~8],对其系统分离与准确鉴定是开展防治工作的基础和前提。本研究直接对香山黄栌枯萎病叶的真菌进行分离鉴定,结果共得到4种丝状真菌,其中细极链格孢(Alternariatenuissima)为优势种,其存在于多种植物病原叶片上,寄主植物种类较为广泛;草酸青霉(Penicilliumoxalicum)通常存在于一些枯枝落叶上,为植物枯萎病叶的主要寄生菌;腊梅拟茎点霉(Phomopsischimonanthi)主要危害腊梅科植物枝条,引起枝枯,属首次在黄栌树种上分离到;葡萄茎枯病菌(Phomaglomerata)作为一种小麦病原菌,能引起植物落叶和腐烂。基于本研究的分离与鉴定结果,并参考这些丝状真菌致病性相关研究报道,能够说明上述4种真菌菌株有可能作为黄栌叶片的潜在致病菌,而关于其致病机理与防治方面的研究与实践还需要进一步开展与实施。4寄生虫真菌的分离和鉴定本研究通过微生物培养分离方法,结合核酸序列和形态学比对手段,从香山黄栌枯萎病叶分离到4种丝状真菌,并分别鉴定为细极链格孢(Alternariatenuissima)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、腊梅拟茎点霉(Phomopsischimonanthi)和葡萄茎枯病菌(Phomaglomerata)。此4种真菌首次在黄栌枯萎病研究中分离到,其中细极链格孢和腊梅拟茎点霉为优势菌种,且为已报道的植物病原菌,可能为香山黄栌枯萎病潜在的病原菌。2.3寄生真菌的鉴定结果通过形态学比对和分子序列系统发育分析,分离到的22株寄生真菌被鉴定为4种,分别为细极链格孢(Alternariatenuissima)、草酸青霉(Peni