无菌制剂的无菌保证及验证（药品生产过程验证课件）

无菌制剂的无菌保证体系

无菌安全的药害事件

“欣弗”事件—-无菌检查的局限性

灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系肉毒杆菌人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状整容手术：利用肉毒杆菌毒素消除皱纹最终灭菌工艺：小容量注射剂输液剂无菌药品生产工艺无菌生产工艺：冷冻干燥工艺

无菌粉末分装工艺一、无菌药品概述（一）无菌工艺和终端产品灭菌工艺的区别以终端灭菌工艺的产品在高质量的环境下进行灌封，但此种产品及其生产环境、容器和密封系统并非完全无菌，最终产品需要进行热压或幅射灭菌。无菌工艺的产品、容器/密封件都必须事先分别用无菌方法处理，再于严格控制的环境下操作成最终的产品，其最终产品不能进行灭菌操作。因此无菌工艺含有更多的工艺变量，各组成部分的灭菌方法也不尽相同，过程引入的偏差环节较多，其任何的人为操作都是潜在的污染源。只有不适用终端灭菌处理的产品才考虑用无菌工艺过程。无菌无热原或细菌内毒素无不溶性微粒高纯度（二）无菌药品的关键特性（三）无菌药品GMP基本原则应最大限度降低微生物、各种微粒和热原的污染，生产人员的技能、所接受的培训及其工作态度是达到上述目标的关键因素，无菌药品的生产必须严格按照精心设计并经验证的方法及规程进行，产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。无菌药品生产的人员、设备和物料应通过气锁间进入洁净区物料准备、产品配制和灌装或分装等操作必须在洁净区内分区域（室）进行。应根据产品特性、工艺和设备等因素，确定无菌药品生产用洁净区的级别。每一步生产操作的环境都应达到适当的动态洁净度标准，尽可能降低产品或所处理的物料被微粒或微生物污染的风险7成品的无菌状态是通过验证来保证的，对最终灭菌产品来说，要通过灭菌程序的验证对无菌产品灌装产品来说，则要通过培养基灌装的试验应综合检查评价批生产记录和无菌检查结果对无菌产品灌装产品，还应包括环境监测记录每种产品的无菌检查方法均需验证。无菌检查的验证及操作必须按药典方法执行如已批准参数放行替代无菌检查，应特别注意整个工艺的验证及监控（四）无菌药品生产工艺的关注点（五）无菌药品质量影响因素分析人员 厂房设施 环境控制设备物料 工艺生产过程9外源性影响因素内源性影响因素

*包括设计及维护QA/QC日常无菌保证消毒操作偏差&环境控制趋势HVAC/公用工程工艺人流物流布局无菌工艺生产线厂房/房间人员培养基灌装（五）无菌保证系统研究的目的和意义为产品无菌保证提供工艺保障为选择的工艺提供科学依据灭菌前工艺－控制微生物污染灭菌前工艺－控制化学反应要素灭菌工艺－杀灭污染菌，提供无菌安全保证，保证化学稳定性产品稳定性－质量和安全性消除风险！（六）无菌产品的无菌保证系统产品设计原辅料和工艺辅助材料的微生物条件的知识，以及可能情况下的控制控制生产过程中的污染，防止微生物进入产品并繁殖，通常需要清洁和消毒与产品接触的表面，防止操作所处的洁净区或隔离器的空气污染，控制工艺时限，可行时采用过滤工序防止已灭菌和未灭菌产品的混淆保持产品的完整性灭菌工艺包括无菌保证系统在内的质量体系总和，如变更控制、培训、书面规程、放行检查、有计划的预防性维护、失败模式分析、预防人为差错、验证校验等人是最大的污染源二、无菌保证环节

—人员控制与管理（一）对生产操作人员手的管理

手的细菌对照实验

未洗的手

漂洗的手（只用清水）

洗净的手（用皂液）

洗净的手（用消毒液）摘自《医务人员手卫生规范》

(WST313-2009)1、洗手哪些情况特别需要洗手?咳嗽、打喷嚏、上厕所、吸烟（包括使用鼻烟）之后；以及休息后返回工作之前；手在接触受污染的材料和动物后,也应当彻底清洗。根据具体的洁净要求,在有些情况下,使用电话和计算机后也要洗手。2、手套的使用操作人员应当避免裸手直接接触药品、与药品直接接触的包装材料和设备表面。这个是我们想到了什么？手套更换手套：每当与比手套不干净物体接触后或手套的完整性受到损害时,请更换外部手套。当外面手套被撕开或损伤后在开始工作设置活动之前和后在气闸间或传递箱内触摸到材料或设备后在地板表面取样本后在工作过程中,手套的消毒处理：进入任何A级区域前在A级区内接触过任何设备,零/配件,工具等在任何干预之前和后在使用电话或对讲机之前和后在正常操作中每10至15分钟无菌操作定时或在任何关键操作前，应消毒手套手套戴法不正确手套破损洁净区人员正确的行为习惯不要坐着不要靠住肘部不要在层流下面的工作台上休息休息时，站着手臂顺着身体下垂不要把双手放在臀部（二）对生产操作人员行为习惯的管理休息时，如果允许坐着手套不能触碰腿或凳椅前臂不能触碰腿手臂不能倚靠在控制板面上双手放在膝盖上不要交叉双手或双脚把信息连络减到最少不过多说话不呼喊或大声叫唤搬运物料时总是放在腰部以上位置以减少污染总是戴上口罩以减少来自口腔的污染无菌操作NOYESYES不操作时，应将前臂和双手放在前面，身体不能斜靠不正确的行为习惯不要因为不正确的着装而散播身体的粒子不要因为没有手套的手接触表面和物料而引起交叉污染不要用手指擦头发或身体其他部位不要在洁净室吃、喝、抽烟或读报等不要在洁净室使用错误的擦布或清洁物料不要在洁净室快速地走、移动、转身不要从前面走进操作者并隔着工作台讲话不要靠在工作台、产品或其他物料上不要把手、手臂和手肘放在工作台上休息不要搬运物料的顶部不要在工作台上滑动物品不要再使用掉在地上的工具和物品等。无菌操作NOYES（三）对生产操作人员着装的管理附录1：无菌药品第二十四条工作服及其质量应当与生产操作的要求及操作区的洁净度级别相适应，其式样和穿着方式应当能够满足保护产品和人员的要求。各洁净区的着装要求规定如下：D级洁净区：应当将头发、胡须等相关部位遮盖。应当穿合适的工作服和鞋子或鞋套。应当采取适当措施，以避免带入洁净区外的污染物。C级洁净区：应当将头发、胡须等相关部位遮盖，应当戴口罩。应当穿手腕处可收紧的连体服或衣裤分开的工作服，并穿适当的鞋子或鞋套。工作服应当不脱落纤维或微粒。A/B级洁净区：应当用头罩将所有头发以及胡须等相关部位全部遮盖，头罩应当塞进衣领内，应当戴口罩以防散发飞沫，必要时戴防护目镜。应当戴经灭菌且无颗粒物（如滑石粉）散发的橡胶或塑料手套，穿经灭菌或消毒的脚套，裤腿应当塞进脚套内，袖口应当塞进手套内。工作服应为灭菌的连体工作服，不脱落纤维或微粒，并能滞留身体散发的微粒。人员着装YESNONO头发应完全包在帽子内无菌工作服的穿着NOYES面罩敞开人员数量应该经过验证证明对无菌环境的相关指标没有影响才能确定最大的人员数量。（三）对生产操作人员数量的管理（四）人员的监控程序操作人员是严重影响无菌产品的关键环节之一，必须建立高度预警且灵敏的人员监控程序。可通过获得每天每个操作工手套的表面样品，或者是每批生产的相关样品来建立监控程序。监控样品还应包括衣物上合理部分的合适取样频率下获得的样品。质控部门必须为那些复杂或是复杂的无菌操作环节的操作工建立一个更加全面的监控程序。对无菌操作人员的监控目标是始终维持在操作过程中保持手套和衣物的无污染状态，单单取操作前的灭菌手套是不够的，因为在后续的操作中微生物会重新繁殖。一旦操作工表面微生物超过建立的规定标准或是显示出不利的趋势，必须立即进行调查。后续采取的措施应包括增加取样、增加观测、重新培训、再确认着装程序、特殊情况下的人员重新调整、安排指定的人员离开无菌操作区域。更衣确认程序的表面监控1、厂房：布局合理2、HVAC系统3、设备设备应适用于产品的生产，易于清洁、消毒或灭菌，宜使用CIP/SIP系统进行在线的清洁、消毒处理。关键参数应安装控制和记录仪表，并应进行校准。无菌区的设备应尽可能采用密闭系统。设备应在确认的范围内使用。共用设备应有防止交叉污染的措施。35二、无菌保证环节

—厂房设施、设备4、环境监测洁净区应制定系统的环境监测方案，包括动态监测和静态监测。关键项目：悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物。取样计划的影响因素：产品类型、生产过程、设施/工艺设计、生产密度、人为干扰、环境监测历史数据等。取样点的选择主要取决于洁净室的设计和生产要求。环境监测计划案例。环境监测动态标准。36

对于无菌生产环境的设计原则主要有如下几点a)无菌操作区为所有无菌的物品、人员、设备、环境的集大成者。b)灭菌后物品尽量在单向层流的环境下运输和存放。c)生产路线尽可能短。d)无菌生产区域尽可能小e)人流、物流分开。f)人流和物流的进出通道分开。清洁工艺时间限制必须包括：生产结束至清洁时间间隔、生产最长时间需清洁、清洁后有效时间时间限制必须包括：大批量产品的配制和灭菌时间间隔、过滤工艺时间间隔、产品暴露在生产线上的时间间隔、无菌设备/容器/密封件的保存时间限制等。不同产品生产环节的时间限制的建立必须有数据支持。生物载量和内毒素载量必须在建立配方加工阶段的时间限制的时候进行评诂。产品过滤的总时间必须建立，以防止微生物穿过过滤器。这个时间限制也可以防止上游的生物载量和内毒素载量的增加。如果过滤器可以提供微生物吸附的基底，必须确定和合理解释其最多的使用次数。二、无菌保证环节

—生产时间控制除菌过滤设备可能存在如下风险滤芯的除菌效果没有验证；在完整性测试中忽视了过滤系统的完整性测试；在滤芯灭菌后安装过程可能带入污染；滤芯的重复使用没有经过充分的验证。过滤操作未尽可能靠近灌装点二、无菌保证环节

—过滤系统过滤是药品溶液无菌处理的常用方法。无菌级过滤器必须验证可以从工艺流中重复去除活的微生物来获得无菌液体。无菌过滤器的孔径应≤0.2um，可以使用一级或多级过滤器。无菌过滤验证中必须包括模拟最差生产条件下的微生物挑战试验和过滤器完整性测试。应选择代表最差情况的生物指示剂评诂其去生物载量的能力，微生物挑战试验常用的指示剂为缺陷假小单胞菌（PseudomonasdiminutaATCC19146)，它的直径为0.3um。灭菌前产品的生物载量必须检测以确定潜在污染微生物的趋势特征。挑战试验所需生物指示剂的浓度至少为107CFU/cm2

（则验证所需指示菌数量＝过滤器滤膜有效表面积×107CFU/cm2

），使用此浓度的目的是为实际生产提供一个安全界限。因为过滤器膜上通常有些孔径比一般孔径要大，有可以使微生物通过的风险，此风险随微生物数量的增加而增大，因此挑战试验的微生物数量非常重要。

直接在产品中使用生物指示菌过滤并培养，虽然是最好的方法，但是如果药物本身具有抗菌作用或是在油性配方中则会导致错误的结论。只要有充分的理由，过滤器对药物制剂配方的有效性可以使用合适的替代方法来评诂，但替代产品不能含有抗菌成分，且模拟的工艺和生产条件必须相同。任何使用与实际产品及工艺条件的模拟物所产生的任何分歧都必须进行合理的解释。在设计无菌过滤验证方案时说明过滤器所允许的极端工艺参数非常重要，一旦过滤验证过于复杂，超出了使用者的测试能力，就必须委托测试或交由滤器制造商测试。但是滤器使用者必须审核过滤验证报告来确保其达到工艺的用途，其数据必须与使用者的产品和生产条件相一致（因为滤器的性能在不同条件下对不同的产品有很大差异）。一旦过滤器被验证通过后，就必须保证实际生产过程中使用相同类别的过滤器。无菌过滤器必须在每批生产后更换，对重复使用的情况必须进行合理解释，其无菌过滤验证必须包括最大的可处理的批数。无菌过滤器应进行完整性测试，其测试必须在过滤工艺开始前和结束后均应进行，以确认其使用前和使用后是否有泄漏和穿孔，可以采用前置流速和起泡点测试来确认其完整性。生产中过滤器完整性测试的规格标准必须同细菌截留验证研究产生的数据相一致。（一）对F0低于8的灭菌程序生产环节降低污染内包装材料灭菌充氮保护灌装前作除菌过滤灌封车间采取适当的空气净化措施

监控生产过程污染状态，避免耐热菌株污染生物指示剂验证证明某灭菌程序能保证污染品在最终产品中所占的概率低于10-6二、无菌保证环节

—灭菌工艺（二）对于热不稳定产品小容量注射剂灭菌条件105℃，30分流通蒸气处方开发热稳定性好的处方选择无菌过滤灭菌程序补充灭菌采用多腔室袋将发生化学变化的组分分隔开（三）干热灭菌设备应备的基本功能①应能够确保被灭菌物品接受的温度和时间②通常设计的灭菌温度应在250～350℃之间，灭菌时间在4～15min内应可控制和调节。③原则上应保证被灭菌物品的灭菌与干燥均在100级单向流(层流)净化空气的保护下进行。④应设置设备内外的空气控制系统，保证设备内部空气处于正压状态，⑤设备应设计有温度控制系统，⑥应为设备的完整性验证试验提供一些方便，例如在设备上设计配置各种验证孔、验证仪表及其辅助设施。（四）热压灭菌设备应具备的条件1、设备能够承受内部灭菌工艺所需的蒸汽压力，同时为保证灭菌腔室内蒸汽分布的均一性2、湿热灭菌设备的门，应设计有防止在蒸汽压力下门被打开的安全装置，3、在内腔室内部和夹套上分别设置疏水装置。4、湿热灭菌设备应具有较强的温度控制能力，5、具有热风干燥功能的设备，还应设置灭菌腔室对外的进气通道，该通道应设置截留微生物的呼吸过滤器，6、湿热灭菌设备应安装有一系列的计量仪器装置(例如温度传感器、温度计、压力传感器、压力表等)（五）湿热灭菌条件1、灭菌釜内热分布均一，要求从产品达到灭菌温度时起，直至加热结束整个过程中温度都能够保持在±0．5℃的波动范围以内；2、检查每种灭菌物装载方式的热分布是否一致；3、灭菌釜内部及灭菌物的温度不得低于预定的灭菌工序所规定的温度；4、确定灭菌釜抽真空所需的时间，满足热分布的要求；5、确定灭菌物达到灭菌温度的时间；6、确定灭菌后可以将设备冷却至40℃以下所需的时间。7、湿热灭菌的标准灭菌时间F0不小于8。基本原则－多视角的质量风险评估和决策从无菌保证角度，选择最可靠的灭菌工艺权衡无菌保证和产品稳定性的风险和利益基本矛盾：无菌质量与产品稳定性无菌质量无法靠检验结果体现通常无菌质量处于优先保证的地位需要考虑产品稳定性，选择对产品破坏小的灭菌工艺（一）灭菌工艺选择的基本原则二、无菌保证环节

—灭菌工艺的开发产品能否121℃，15分钟湿热灭菌采用热压灭菌121℃，15分钟湿热灭菌是否能否采用F0≥8的湿热灭菌，以达到SAL≤10-6采用F0≥8的湿热灭菌，以达到SAL≤10-6是否能否对药液除菌过滤药液除菌过滤及无菌灌封无菌原料，无菌配制无菌灌封是否溶液剂型产品灭菌工艺的决策树产品能否160℃中热灭菌120分钟采用160℃中热灭菌120分钟是否产品是否可在其它条件下干热灭菌，以达到SAL≤10-6采用另一种替代时间和温度条件进行标准周期干热灭菌达到SAL≤10-6是否产品是否可采用其它非干热灭菌药液除菌过滤及无菌灌封无菌原料，无菌配制无菌灌封是否非溶液剂型、半固体或干粉产品灭菌工艺的决策树无菌保证灭菌工艺灭菌前微生物污染灭菌设备灭菌工艺验证二次污染包装密封性原料设备和生产过程生产环境生产时限无菌保证管理体系决定无菌保证的主要环节灭菌工艺灭菌前微生物控制要求类别过度杀灭F0≥12低，不必每批监控污染菌最终灭菌工艺，无菌保证值≥6残存概率F0≥8高，应每批监控污染菌，尽量加入除菌过滤器，应有原料微生物标准F0<8很高，必须采用除菌过滤，每批监控灭菌前污染菌（或过滤前污染菌），监控每批灌装区的环境非最终灭菌工艺（无菌生产工艺）无菌保证值≥3（二）灭菌工艺与灭菌前微生物控制的关系过度杀灭(热稳定性产品)–产品灭菌工艺的F0值不低于12分钟;–121℃×15分钟过度杀灭设计目的：使D=1分钟，数量为106的微生物经过灭菌后达到SAL=10-6。热敏感性产品–控制产品在灭菌前的带菌量–产品灭菌工艺的F0值不低于8分钟.灭菌工艺选择依据过度杀灭F0≥12热稳定性很好，同类产品已采用残存概率F0≥8热稳定性较好，同类产品已采用F0<8理论和实验充分证明热稳定性差（三）灭菌工艺选择的依据决策树越往下，风险越大需要提供否定优先工艺的必要证据确定无菌保证工艺参数确定灭菌设备的控制精度灭菌工艺验证的精密程度灭菌前微生物生产环境洁净度（四）为选择灭菌工艺而作的研究影响产品热稳定性的因素分析灭菌提供了高温，触发、加快化学反应文献或基础科学依据活性成分的化学结构是否稳定活性成分在高温下可能进行的化学反应从化学反应的基理揭示反应的必要内因和外因氧化还原反应聚合和环合反应水解反应其它反应1、研究的前期准备研究化学反应的内因和外因标准的灭菌工艺下，通过改变某些条件，限制化学反应探索其它灭菌工艺，能否降低化学反应量2、选择灭菌工艺的研究过程3、灭菌程序的开发与设计根据灭菌前带菌量进行设计–基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的热稳定性–灭菌后产品的污染概率须小于10-6

。♦过度杀灭法–基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上一定的安全系数；–理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到10-12。♦将两者相结合–兼顾产品的热稳定性和无菌要求。例：湿热灭菌工艺研发与确认非产品特异性灭菌工艺（过度杀来灭法）产品特异性灭菌工艺蒸汽不可穿透型物品（液体型）蒸汽可穿透型物品饱和蒸汽型预真空式重力式空气超压型蒸汽/空气混和方式过热水方式确定参数升温阶段保温阶段降温阶段物理学方法温度分布热穿透生物学方法日常放行工艺评估系统适用性再确认变更控制方法设计装载类型工艺类型工艺开发性能确认连续控制工艺研发阶段工艺确认阶段灭菌工艺的验证热敏感性物品？产品特定性灭菌工艺过度杀灭法灭菌工艺物品类型？排除空气？需要过压空气？蒸汽穿透型液体型是预真空式灭菌工艺否已安装预真空装置？是否重力沉降式灭菌工艺否任何湿热灭菌工艺是可直接与水接触是否过热水灭菌工艺蒸汽-空气混和型灭菌工艺4、灭菌程序的效力测定生物学手段（FBiological）–用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂–数据直接反映灭菌效果–有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶)–局限性：较难进行统计学分析物理/数学手段（FPhysical）–用灭菌值F0作为评价标准–精确测定热分布和热穿透状况–便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果–测量数据便于统计学分析一、湿热灭菌工艺的验证验证对象–灭菌器、产品装载方式及产品验证内容确认（IQ、OQ）：灭菌设备的运行符合设计要求验证（PQ）：产品灭菌程序的有效性和重现性评估：灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来的影响二、无菌保证环节

—灭菌工艺的验证（一）确认（IQ、OQ）检查设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所有零部件均与采购要求相同；控制/监测仪表的校验，包括程序控制器、温度压力和时间控制设备，以及计时器、记录测量仪等；（二）湿热灭菌工艺（性能）验证灭菌腔体的热分布试验被灭菌物在不同装载方式下的热穿透试验使用嗜热脂肪杆菌为灭菌生物指示剂的验证试验

逻辑递进测定产品实际温度和F0值以热分布（空载、满载）试验结果为基础，进一步确定实际样品（或模拟样品）的冷点.找出冷点多个温度探头均匀/在腔室内，重复运行代表性灭菌程序，记录个点温度变化曲线，计算各点温差。通过比较各点温度与平均温度的差异确定冷点空载热分布热穿透验证和微生物挑战试验满载热分布找出装载方式下的冷点以空载试验结果为基础更接近实际情况1、热分布试验目的了解灭菌柜内温度均匀性，确定柜内“冷点”位置和“冷点”温度滞后时间空载热分布试验重现性要求：柜内各点温度差应≤±1℃（用于最终灭菌产品的灭菌器可能要求更高的温度均匀性，比如±0.5℃。）-空载热分布测试中三次全过程灭菌循环必须呈现均匀的热分布，没有冷点，全部温度探头的平均值＜1℃。例如一个离散测量值低于平均值-1.4℃，假设平均值122.4℃，测量值为121℃），则这个位置存在冷点。则要求最冷点温度大于要求的温度点。满载热分布测试方法：探头分布同空载热分布测试放置同一的位置，可以监控灭菌介质的均匀性和稳定性。标准：最冷点与灭菌腔平均温度间的差值应不超过±1℃。注意：温度探头不能接触固体表面，不应放置在任何容器内。2、热穿透试验

目的确认灭菌柜对某品种灭菌程序的有效性了解某灭菌条件对不耐热产品的适用性探头位置蒸汽入口处高温点“冷点”位置待灭菌产品内测试方法：热探头分布在系统蒸汽最难到达的区域，均质灭菌物（如胶塞）时应考虑反映几何中心、角落、柜顶部和底部。最难穿透的部位重复3次试验。特定负载的冷点或结构用于判定日常循环中的暴露时间，确保整个负载都暴露于充足的杀灭力。标准：最冷点灭菌条件符合灭菌保证值要求3、生物指示剂验证试验-过度杀灭工艺生物指示剂（biologicalindicator,BI)定义：是指对特定灭菌方式具有明确而稳定的耐受性的微生物制备物，是由特定菌株的纯活性培养物制备而成。注：生物指示剂也称BI挑战系统（BIChallengeSystem)或微生物挑战系统（MicrobiologicalChallengeSystem)目的（1）用于评价一个灭菌程序对被灭菌物品的灭菌效果，从而对灭菌程序进行性能确认和定期再确认（2）可用来测试无菌隔离系统和无菌环境的消毒效果生物指示剂包装形式：（1）将已知数量和耐受性的纯种孢子接种于固体材料（滤纸条或片、绵线、玻璃或金属薄片等）上。此类生物指示剂一般要直接接触灭菌介质，灭菌后再接种到培养基培养。（2）孢子悬浮液：使用前将孢子悬浮液定量接种于被灭菌物品内或物品表面（3）自带培养基型生物指示剂：此类应经验证，证明在灭菌后指示剂内的培养基仍能保证活性微生物的萌发和恢复生长。

耐热孢子接种入待灭菌产品中，在设定灭菌条件下进行灭菌计数，计算残存率＜10－6用于湿热灭菌法的生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌孢子NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953生孢梭菌孢子NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955生物指示剂与温度探头并列在同一部位(10-20支)，按规定条件培养生物指示剂，如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为55～60℃，培养7天，每天检查。所有经受挑战试验的样品均呈阴性

生物指示剂验证–非过度杀灭工艺选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂生物指示剂的耐热性–不得低于孢子在相应产品中的耐热性–不得低于产品中污染菌的耐热性–用于每次挑战试验的所有BI(BiologicalIndicator,生物指示剂)批号必须相同.生物指示剂的接种量计算生物指示剂的接种量计算考虑要素:1.灭菌标准SAL≥62.产品Bioburden≤10孢子/产品注:Bioburden是生物负载的意思,是指被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数3.产品灭菌工艺的F0下限4.BI的耐热性资料5.BI在挑战试验前、后的计数方式计算方法：F0＝D121×（logNo－logNt）Nt＝2.303×log（n/q）n：每次挑战试验用生物指示剂数量q：挑战后呈阴性的生物指示剂数量，如果全部都是阴性，则假定q＝n-1生物指示剂验证案例

某公司生产的三种大输液产品A、B和C，与微生物相关的基本参数如下表，请根据以上参数设计上述产品灭菌程序进行生物指示剂验证方案。灭菌前含菌量控制限度CFU/瓶污染菌耐热性限度温度×时间F0控制范围(分)验证用孢子在其中的耐热性D121A≤1000DC≤DBI117℃×259-130.8分B≤100DC≤DBI117℃×208.5-120.9分C≤1000DC≤DBI118℃×209-130.7分可选择产品B代表上述三产品进行验证－生物指示剂在其中的耐热性最高,而灭菌程序的F0值的下限低于其它二产品－但验证时要以1000CFU/瓶作为污染菌含量－通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降9个对数单位,所需F0为D121×Δlog=8.1分－最低F0满足要求确定验证用芽孢在每瓶产品B中的接种数量F0=D121.1×(logN0-logNt)Nt=2.303×log(n/q)结果：每瓶产品B中的生物指示剂接种量要达1.2×109CFU由F0=8.1;N0=1000;D121.1=0.9得Nt=10-610-6=2.303×log(n/q)验证合格判断—湿热灭菌79项目次数最高值、最低值与平均值温差F0值空载热分布3次≤±1℃满载热分布3次≤±1.5℃（普通制剂）≤±2.5℃（大容量制剂）热穿透试验3次最低F0>8；最低F0值与平均F0值的差值≤2.5min微生物挑战性试验微生物残存率<10-6（三）验证示例

快冷式灭菌器的验证验证目的腔室内最冷点保证F0＞8灭菌釜装载能力250ml2000瓶500ml1000瓶灭菌条件饱和蒸汽灭菌，115.5℃，30min灭菌程序装载→升温，进蒸汽置换空气→保温灭菌→排气→预热水冷却→卸瓶1、温度探头装载图

2、探头位置探头号探头位置探头号探头位置14-B-Ⅱ62-B-Ⅲ24-C-Ⅲ72-A-Ⅰ34-A-Ⅰ81-B-Ⅱ43-A-Ⅰ91-C-Ⅳ53-D-Ⅳ101-A-Ⅰ3、热分布测试检查柜室内热分布情况，确定腔室冷点探头位置蒸汽进口处、冷凝水排放口、温控探头旁热分布测试腔室底部腔室平均温度温差验证空载热分布115.5℃116.3℃＜0.9℃装载热分布114.7℃115.7℃＜1.1℃4、热穿透试验确认装载中的“最冷点”在灭菌过程中应获得充分的无菌保证值。装载类型：500ml玻璃瓶，968瓶；灭菌条件：115.5℃，30min验证评价三次结果分析，腔室内各点均达到F0＞8的要求热穿透试验运行结果数据

灭菌时间/探头1246810控制探头10：00808294989997108℃10：01848596101102100110℃10：22116115116116116116118℃10：23115115116116116116118℃…………………………10：44100100101989710086℃F0值/min9.129.3410.310.310.61.055、生物指示剂挑点性试验验证目的设备最冷点的产品能保证达到无菌生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌含量ATCC79535×106个/支试验步骤灭菌柜内满载模拟产品柜内最冷点放入至少2支生物指示剂按照大容量注射剂灭菌岗位SOP操作灭菌生物指示剂56～60℃培养48h未灭菌生物指示剂1支作为阳性对照品观察生物指示剂颜色变化二、干热灭菌工艺的验证用于包装用的玻璃容器或金属制品的灭菌和去热原灭菌效果必须保证FH值大于60min去热原效果必须保证FH值大于120min干热灭菌设备对流间歇式——干热灭菌柜对流连续式——隧道式灭菌干燥机（一）隧道式干热灭菌器隧道式干热灭菌器功能

预热段（A）A段设抽风机去除湿气，形成合理气流方向干热灭菌段（B）辐射热使小瓶迅速升温温度传感器控制灭菌温度范围灭菌、去热原冷却段（C）1、验证项目

隧道式干热灭菌器压差干热灭菌程序干热灭菌的效果直接与传送带的走速有关，走速330℃80mm／min；340℃l00mm／min统计280～340℃瓶温的持续时间装载方式验证空载满载2、验证标准空载验证项目热分布温差可接受标准≤±15℃(空载热分布测试过程中温度传感器至少10支以上)满载验证项目热分布温差可接受标准≤±15℃热穿透可接受标准：瓶温280～340℃瓶子澄明度符合针剂澄明度标准细菌内毒素：鲎试剂法显阴性，按USP法降低3个对数值

验证合格判断—干热灭菌94项目次数最高值、最低值与平均值温差FH值空载热分布3次≤±15℃满载热分布3次≤±15℃热穿透试验3次最低FH>60min；微生物挑战性试验鲎试剂凝胶法显阴性或按USP法降低3个对数值隧道腔室压差层流热空气风速均应>2.5m/s，自净1min3、验证程序

设计铂电阻探头位置空载热分布试验查明冷点、热点位置满载热穿透试验典型装载：最大装载、最难被热穿透的物品灭菌物品达到最低灭菌温度的时间—滞后值记录空气和被灭菌物品在升温、降温过程中的温度变化速度4、灭菌效果验证

——微生物挑战性试验耐热孢子：枯草杆菌黑色变种芽孢160℃下D值为1.9121℃下D值为5.0大肠杆菌内毒素制作“标的物”每列瓶中各加入1000单位的细菌内毒素“标的物”放在用于热穿透试验的热电偶附近

5、验证合格标准检查瓶内细菌内毒素的残存量污染菌的存活概率小于10-12细菌内毒素至少降低3个对数单位的要求湿热灭菌与干热灭菌工艺比较灭菌工艺灭菌工艺目的生物指示剂标准灭菌条件等效灭菌条件湿热灭菌灭菌嗜热芽胞杆菌121℃，Z＝10℃SAL≥6F0≥8干热灭菌灭菌枯草芽胞杆菌170℃，Z＝20℃SAL≥6FH≥60去热原170℃，Z＝54℃SAL≥12FH≥120隔离技术（IsolationTechnology）早在20世纪80年代就出现，以全封闭局部控制理念替代了全室控制洁净+无菌+隔离=隔离技术二、无菌保证环节

—无菌操作新版GMP附录一：无菌药品第四章隔离操作技术第十四条采用隔离操作技术能最大限度降低操作人员的影响，并大大降低无菌生产中环境对产品微生物污染的风险。高污染风险的操作宜在隔离器中完成。隔离操作器及其所处环境的设计，应能保证相应区域空气的质量设计成单门或双门、甚至可以是同灭菌设备相连的全密封系统。物品进出隔离操作器应特别注意防止污染。隔离操作器所处环境的级别取决于其设计及应用。无菌操作的隔离操作器所处环境的级别至少应为D级。

第十五条隔离操作器只有经过适当的验证后方可投入使用。验证时应当考虑隔离技术的所有关键性因素，如隔离系统内部和外部所处环境的空气质量、隔离操作器的消毒、传递操作以及隔离系统的完整性。第十六条隔离操作器和隔离用袖管或手套系统应进行常规监测，包括经常进行必要的检漏试验。为什么要用隔离技术（1）相对于最终灭菌的产品而言，非最终灭菌产品的无菌操作工艺存在更大的变数。（2）每一个操作过程中产生的错误都有可能导致产品的污染。（3）一些手动或机械的操作在无菌操作过程中存在很大的污染风险。（4）保护产品和保护操作人员的需要。（5）法律法规的要求常见的隔离系统RABS：Restrictiveaccessbarriersystems，限制通道的屏障系统。RABS可以分为主动式（Active）和被动式（Passive）C-RABS：Closed-restrictiveaccessbarriersystems，密闭式限制通道的屏障系统。ISOLATOR:隔离装置几种隔离系统的区别项目O-RABSC-RABSISOLATOR与外界环境密封情况非密闭密闭密闭保护对象产品产品和操作者产品和操作者气流方向层流层流层流或湍流内部压力正压正压或负压正压或负压回风形式直接房间取排风自循环自循环压力控制不控制控制严格控制灭菌手动灭菌自动VHP自动VHP外部环境级别（EU-GMP）B级B级D级传统无菌室与无菌隔离系统的比较项目传统无菌室无菌隔离系统对产品的防护程度与操作人员有关完全防护对操作人员的防护程度防护小完全防护所需能耗大小物料传递会导致无菌环境变差，与操作人员有关可以实现在无菌条件下快速传递工作环境的控制难以控制控制方便工作服的更换每天至少三次简单操作和维护成本高低隔离系统所处外部环境最低为D级隔离技术关键要素-手套（Glove）隔离技术关键要素-半身衣（Half

suit）限制人对无菌产品污染（太空服）开放式限制进出隔离系统——oRABS•外部洁净室的环境为B级•核心生产区域为A级，整体为B+A•操作者在B级区域，通过手套来进行A级区域的操作•通常的灭菌方式是和B级区域一起灭菌•操作者和A级区域是完全分隔开的–聚碳酸酯或钢化玻璃门–手套口和无菌传递设备。由AGV小车对应冻干机，在于上下游对接的轨道段和AGV小车上装有oRABS.封闭式限制进出隔离系统——cRABS•外部洁净室的环境为B级;•核心生产区域为A级，整体为B+A;•与工艺操作人员完全隔离;•只有在机器停止（非生产状态）时才能打开;•操作人员只能通过手套对内部进行干预;•操作人员通过无菌传递接口传送物品;•内部进行整体VHP消毒;•运行时内部维持一定压差;

隔离器（Isolator）思路：灌装生产环境实体（物理）隔离隔离器（Isolator）是最早出现的一种全封闭隔离装置，内为单向流，对外保持微正压，可达到ISO5级标准，工作人员仅依靠手套孔操作，使装置内部高洁净度不受外界影响。隔离器对外环境的要求为不低于ISO8级。胶塞转移工艺单向流小车胶塞转移工艺输送机无菌传输对接胶塞转移工艺呼吸袋包装灭菌胶塞转移工艺洗涤灭菌干燥一体处理，无菌转移胶塞工艺呼吸袋包装灭菌胶塞转移工艺呼吸袋通过RTP无菌传输口向加塞机中转移胶塞输送机无菌传输对接胶塞转移工艺1、胶塞清洗和灭菌分离的方法，即胶塞清洗后使用蒸汽呼吸袋包装，然后在蒸汽灭菌机内灭菌。2、灭菌后胶塞运输至灌装机旁，在RABS胶塞缓冲区内去外包装后进入RABS。3、在RABS内用手套开内包装，之后加到灌装机的胶塞加料斗内。洗涤灭菌干燥一体处理，无菌

转移胶塞工艺（二）质量风险1、质量风险表现（1）工器具、胶塞清洗灭菌后转移、操作干扰暴露表面；（2）灌装机运行中途维修人员干预导致污染；（3）灌装泵及零部件拆装过程人员干扰污染无菌表面；（4）灌装过程中人员干预影响高风险环境；2、风险控制工程措施（1）选用稳定的设备或使用高速设备降速使用提高稳定性，避免或减少无菌操作过程维修人员干预对产品污染。（2）使用屏障或隔离技术，限制关键操作区域人员的进出，使控制区域内的人流、物料移动频率最少；（3）选择能够有效控制人员的活动对半加塞制品污染的进出料方式（4）移动罐方式生产，灭菌后用无菌软管焊接器将无菌药液储罐与灌装机的缓冲罐药液管道无菌连接。（5）灌装机药液接触部分在线清洗(CIP)、在线灭菌(SIP)，减少灌装泵及零部件拆装过程人员干扰。参数放行：根据有效的控制、监测以及灭菌工艺验证的数据资料，对产品的无菌保证进行评价，以替代根据成品无菌检查结果的放行系统参数放行：最早是由美国百特公司1981年第一次在美国向FDA提出申请的。1985年1月，FDA首次批准百特对其大小容量输液产品实行参数放行。参数放行：在欧盟1997年版GMP与欧州药典(1997年版)均被引入1987年，FDA颁布了第一部《参数放行政策指南》，首次承认过程控制优于结果检验。三、无菌保证

—参数放行法我国参数放行现状2005年3月1日，是我国药品生产企业试点参数放行的“起跑线”，批准无锡华瑞制药有限公司、广州百特医疗用品有限公司两家企业开始进行为期两年的参数放行试点。涉及的产品主要是由湿热灭菌法生产的大容量注射剂和小容量注射剂。欧美国家的参数放行美国针对四种灭菌方式:湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌欧洲针对三种灭菌方式:湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌实行参数放行的意义–灭菌工艺验证的自然结果–克服成品无菌检查的统计学局限性和不精确结果–减少质量控制成本–缩短生产周期，降低库存压力参数放行的实践要求参数放行须得到政府部门的批准严格控制和监测灭菌前产品中的微生物污染状况严格控制灭菌工艺须用指示剂监控每个灭菌批须有区分已灭菌和未灭菌产品的系统容器的密封完好性验证参数放行法的工艺流程控制1、列出灭菌工艺的操作步骤2、明确每一关键参数的一级和二级控制限度3、明确必须报警的运行参数及机械性能参数4、安装足够的辅助性传感/测量仪器给予主系统充分的保障5、保证所有的工艺参数监测器均处在经校验的合格状态下工作6、产品灭菌工艺验证之前应首先对灭菌釜进行彻底的（空载）性能确认7、分别在满载或部分装载状态下，验证灭菌设备的性能。参数放行中的灭菌工艺关键参数1、腔室温度（一级控制、二级控制，温度仪表）2、腔室压力（一级控制、二级控制，压力仪表）3、灭菌时间（