木霉菌株d31对立枯丝核菌的拮抗作用

木霉菌株d31对立枯丝核菌的拮抗作用

属于半知菌亚门的丝杆菌属（psp）。集体甘醇菌属于半知菌亚门。这是一种常见的生态环境，如土壤、根、叶、种子和茎。木霉菌是植物病害重要的生防菌,现已发现哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、绿色木霉菌(T.viride)、康氏木霉菌(T.koningii)、钩状木霉菌(T.hamatum)和长枝木霉菌(T.longibrachiatum)等对多种植物病原菌表现拮抗活性。不同的木霉菌生防机制不尽相同,一般认为竞争作用、重寄生作用、产生降解病原真菌细胞壁的水解酶是木霉菌主要的生防机制。随着木霉菌生防机制研究的不断深入,抗生物质等木霉菌代谢物的拮抗作用受到关注。木霉菌产生的抗生物质多为次级代谢产物,具有菌株的特异性,不同菌株的代谢产物不尽相同。这些抗生物质包括了戊酮、辛酮、类萜、多肽和氨基酸衍生物等几大类。同时还发现绿色木霉能产生可挥发性的次级代谢产物,通过影响其他真菌的蛋白质合成和生长速度起到抑菌作用。研究木霉菌产生的这些拮抗性代谢产物将对新型生防制剂创制具有重要意义。立枯丝核菌是重要的土传植物病原真菌之一,可引起多种作物的立枯病和根腐病,为了明确木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌的拮抗作用,并为深入研究木霉菌拮抗机制和代谢产物开发利用提供科学依据,本试验研究了木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌菌丝生长和菌核形成等方面的影响。1材料和方法1.1巷道品种—材料供试木霉菌株Td31和立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)菌株Rs由青岛农业大学农业应用微生物室选育;供试茄子(Solanummelongena)品种济农2000由济南市农业科学研究所提供;供试培养基为PDA培养基、麸皮培养基和液体发酵培养基(NH4NO33g、葡萄糖45g、K2HPO41.5g、KCl0.75g、MgSO4·7H2O0.75g、FeSO4·7H2O0.015g、水1L、pH=6),每个500mL的三角瓶中装100mL液体发酵培养基,121℃灭菌30min。1.2培养方子悬浮液试验于2007年3~12月在青岛农业大学进行。每瓶液体发酵培养基接种8×106个孢子·mL-1的木霉菌孢子悬浮液2mL,置QYC2112双层全温摇床上,25℃、180r·min-1培养5d。以此培养物为种子,按6%的接种量接入10L不锈钢全自控发酵罐,25℃液体深层发酵11d。发酵液用细菌过滤器抽滤,滤液一部分直接转入无菌的三角瓶中4℃保存备用(简称A液,下同),另一部分121℃灭菌20min,保存备用(简称B液,下同)。1.2.1生长曲线测定培养条件用融化的PDA培养基分别将A液、B液稀释成1,5,10,20倍,制成含不同浓度A液和B液的PDA平板。在平板中央分别接0.6cm的立枯丝核菌菌丝饼,以液体发酵培养基同比稀释的PDA平板接种立枯丝核菌为对照,25℃下培养,每天观察、记录立枯丝核菌的生长情况,测量菌落直径直至对照长满平板(处理5d),并计算抑菌率,抑菌率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100,试验设3次重复。1.2.2培养立枯丝核菌用滴管在灭菌的载玻片中央滴一滴A液,然后用接种钩挑取立枯丝核菌的菌丝放入其中,小心的将菌丝分散开,盖上盖玻片。同样方法,制备B液试验玻片。将制备好的玻片放于显微镜下连续观察菌丝体和细胞的形态变化。用A液均匀的喷洒在用PDA培养7d的立枯丝核菌菌丝上。每隔2h挑取立枯丝核菌菌丝制片观察菌丝的变化情况。1.2.3不同浓度a液和b液对培养立枯丝核菌核的影响发酵液对立枯丝核菌菌核形成试验处理方法同1.2.125℃下培养至对照平板菌核大量形成,观察、记录不同浓度A液和B液处理对立枯丝核菌菌核形成的影响。将立枯丝核菌接入PDA培养基中,25℃下培养约20d至有大量菌核生成,用无菌水将A液分别稀释成1,5,10,20倍液。无菌条件下将菌核挑出用不同浓度的A液浸泡30min,用无菌水冲洗5次,再用灭菌的滤纸吸净残液,然后把菌核接入PDA平板中,每个培养皿均匀分散放置10个菌核,每个浓度处理做3皿。B液处理同A液,以未浸泡的菌核接入PDA平板为对照。25℃下培养,观察、记录菌核萌发情况。1.2.4立枯丝核菌诱导育苗用A液和B液原液和稀释成5,10,20倍的稀释液浸泡茄子种子约4h。盆栽试验土壤用40%甲醛1L·m-3消毒,试验地点在青岛农业大学农业试验站,4月26日播种。每个花盆中加入消毒土并接入立枯丝核菌麸皮培养物3g,充分混匀后播撒不同浓度发酵液处理的种子20粒。以接种立枯丝核菌而播种未用发酵液处理过的茄子种子作对照,每处理设3次重复。从出苗开始每天调查1次发病情况,共调查15d,统计健株数与病株数,每次调查后清除病株。计算发病率和防治效果,发病率(%)=(死苗数/总出苗数)×100,防治效果(%)=[(对照发病率-处理发病率)/(对照发病率-空白对照发病率)]×100。2结果与分析2.1不同稀释频次木霉菌抑菌率结果木霉菌代谢产生的抑菌物质可强烈抑制RS的菌丝生长(表1)。以A液稀释1倍处理的抑菌率最高,为87.7%;稀释20倍时抑菌率低于50%,随着木霉菌发酵液稀释倍数的增加,其抑菌效果随之下降,差异极显著。A液与B液对立枯丝核菌菌丝生长抑制作用的趋势相同,只是B液比A液的作用强度略低。发酵液稀释1倍处理培养5d后,RS菌丝消解并消失;发酵液稀释5倍处理培养5d后,RS菌丝几乎不再生长。2.2不同浓度木霉菌对枯丝核菌菌核萌发的抑制作用由表2可知,木霉菌代谢产生的抑菌物质可强烈抑制立枯丝核菌菌核的形成,随着木霉菌发酵液稀释倍数的增加抑制效果逐渐下降,菌核形成量逐渐增加;稀释20倍时菌核形成量与对照相近。不同浓度的木霉菌发酵液对立枯丝核菌菌核萌发的抑制效果不同,处理间差异极显著。其中A液稀释1倍处理对立枯丝核菌菌核萌发的抑制作用最强,菌核萌发率仅为43.3%,而对照菌核萌发率为100%。发酵液浓度越高,菌核的萌发率越低,但是发酵液尚不能完全抑制菌核的萌发。A液和B液在相同浓度下对菌核萌发率的影响差异不明显。2.3b液质及立枯丝核菌的菌落喷洒A液处理2h的立枯丝核菌菌丝原生质浓缩;24h后有大量的细胞内含物质减少,细胞中出现小空泡,有的细胞中甚至看不到细胞质,仅剩细胞壁。A液作浮载剂显微观察发现,大约2h后,菌丝细胞的原生质浓缩(图1-A),有的细胞质变稀薄,24h后可观察到立枯丝核菌的菌丝变形、原生质浓缩并溢出(图1-B),大多数菌丝仅见细胞壁,少数菌丝细胞中可见原生质,但是细胞质稀少且聚集,出现大量的空胞(图1-C)。48h后观察发现立枯丝核菌的菌丝细胞壁消解(图1-D)。这说明木霉菌在发酵过程中,产生了大量的破坏立枯丝核菌菌丝的生物活性物质。B液作浮载剂处理立枯丝核菌也发现类似的现象,在变化进程上略慢于A液处理,但是48h后未见菌丝消解(图1-E,F,G)。处理48h对照未见变化(图1-H)。可见,木霉菌发酵液中的生物活性物质经高温处理后仍具有很强的破坏立枯丝核菌菌丝的活性。2.4发酵液浓度对酵母粉病株率的影响由表3可知,不同浓度木霉菌发酵液浸种均可明显降低立枯丝核菌引起的茄子立枯病病株率,差异极显著;而且其防治效果随发酵液浓度的增加而提高,发酵原液最高防效达69.8%,故高浓度下防治效果较为理想。A液和B液在相同浓度下对立枯丝核菌防治效果有一定差异,发酵滤液经高温灭菌后,防病效果略有下降但差异不显著。3抗菌活性物质木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌有拮抗作用,其能破坏菌丝,使细胞中的原生质浓缩、空胞化,细胞壁消解、细胞质外溢、菌丝体变形、解体;木霉菌株Td31代谢产物能抑制立枯丝核菌菌丝的生长及菌核的形成和萌发。采用木霉菌株Td31发酵液浸种可以有效地防治立枯病,并且发酵液浓度越高,防病效果越好。过滤除菌的发酵液稀释1倍处理菌丝生长抑菌率为87.7%,可完全抑制菌核的形成,菌核萌发抑制率为56.7%,发酵原液浸种对立枯病防效高达69.8%。随着木霉菌发酵液浓度的降低其抑菌效果也随之下降,差异极显著。木霉菌株Td31产生的拮抗物质具有耐高温性,121℃处理20min对拮抗活性无明显影响。木霉菌株Td31是本课题组从抑病土壤中分离并经诱变筛选获得的一个木霉菌株,对立枯丝核菌、镰刀菌、苹果轮纹病菌和苹果炭疽病菌等多种土传病原真菌具有很强的拮抗作用,防治立枯病效果显著。研究中发现该菌株代谢产生抑菌物质是主要的生防机制,并且代谢产物抑菌活性强,热稳定性高。产生可以降解病原真菌细胞壁的水解酶是木霉菌生防机制之一,但是121℃处理20min能保持较高生物活性的木霉菌产生的胞壁水解酶目前尚未见报道,所以这种拮抗物质不可能是酶,应为一种或一类耐高温的抗生素,一些相关研究也证实了这一点。孙彩云等发现木霉菌株SMF2产生的抗生物质可以抑制细菌生长,将其孢子胞外分泌的抗生素命名为木霉素,并认为这是抑制青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)生长的主要物质,该物质对热稳定,将其100℃灭菌10min后仍有一定抑菌能力。曹翠玲等发现康氏木霉代谢物可使苹果树腐烂病菌(Valsamali)菌丝干重明显降低,培养滤液121℃湿热灭菌30min与过滤灭菌处理相比,在同一浓度下对菌丝干重的影响在F0.05水平上无明显差异。朱天辉等用木霉菌胶霉毒素生产发酵液静置培养哈茨木霉(T.harzianum)菌株FO60,将发酵液分别湿热灭菌及过滤灭菌后以一定体积比加入形成菌核的培养基中,接种等量的立枯丝核菌(Rsolani)后,均能抑制R.solani菌落生长和降低菌丝干重,湿热灭菌后其抑菌效果与未灭菌物质比较无明显差异,表明其非挥发性物质具有热稳定性。哈茨木霉产生的挥发性代谢产物可以抑制立枯丝核菌菌丝的生长及菌核的形成,且随时间增加有积累效应。孙冬梅等在黄绿木霉代谢物中也发现热稳定性抑菌物质存在,这些不同木霉菌产生的耐高温抑菌物质是否属于同一种或者是同一类化学物质,尚有待于深入研究。拮抗作用显微观察发现,过滤灭菌比高温灭菌的发酵液破坏立枯丝核菌菌丝的速度快,进一步研究发现过滤灭菌的发酵液可检测到几丁质酶活性,说明木霉菌株Td31拮抗作用虽然以产生耐高温的抗生素为主,但同时可能也产生一些立枯丝核菌细胞壁降解酶类,以增强抗生素的拮抗作用。