亚土木酚素提取物对糖尿病小鼠早期肾损伤的影响

亚土木酚素提取物对糖尿病小鼠早期肾损伤的影响

木酚素是存在于可食植物中的植物化学物质。结构上属于多酚类化合物。木酚素的化学结构与雌激素非常相似。它可以与雌激素受体结合，显示雌激素或抗雌激素活性。亚麻木酚素(FlaxseedLignanExtract,FLE)是从亚麻籽中分离出来的植物木酚素。研究表明它除对内源性激素的代谢起作用外,同时具有一定的抗氧化活性,可以预防某些肿瘤(如前列腺癌与乳腺癌)、心血管疾病及糖尿病的发生,但国内关于亚麻木酚素对糖尿病及并发症的防治作用尚未见报道。本课题在进行了亚麻木酚素提取物对糖尿病小鼠肾脏保护作用的初步研究,以便为寻找天然植物药物及开发保健品提供实验依据。1材料和方法1.1动物、材料与正常剂量健康雄性ICR雄性SPF级小鼠100只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,体重18～22g,合格证号:SCXK(沪)2003-0003号。饲养条件:江苏省疾病预防控制中心SPF级实验动物室,环境设施合格证号:SYXK(苏)2002-0004;环境温度:(22±2)℃;相对湿度50%～60%。全部动物给予灭菌鼠饲料和灭菌水,自由取用。适应性喂养1星期后,禁食6h,按170mg/kg腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)。STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH4.5)配制,使用前过微孔滤膜除菌。同时设立正常对照组(NC组,n=12),注射等量的枸橼酸钠缓冲液。正常饮食,不使用胰岛素及其它降糖药物。72h后测血糖高于16.7mmol/L,则造模成功。1.2高、中、低剂量治疗造模成功后按血糖随机分为5组,每组12只。糖尿病对照组(DC组)、二甲双胍治疗组[D+MEF组(100mg/kg,昆山双鹤药业有限公司,批号:0501231)]、亚麻木酚素提取物治疗高、中、低剂量组[D+HFLE组、D+MFLE组、D+LFLE组,由本试验室制备,开环异落叶松脂素(SECO)含量为301mg/g,剂量分别为0.6、1.2、3.6g/kg]。各治疗组用药均在临用前用双蒸水配成混悬液,DC组及NC组则灌予等量双蒸水。灌胃体积均为0.1mL/10g体重。每组灌药1次/天,连续给药8周。1.3肾组织病理学检查各组小鼠喂养8周后,于代谢笼中收集24h尿液,于-30℃冰箱中保存待用于测定尿微量白蛋白。麻醉处死后取双肾,去除包膜,用冰冷的生理盐水洗去表面污物后称重,左肾用10%福尔马林溶液固定,待作病理检查。其余标本取0.2g左右组织用生理盐水制成5%的组织匀浆,3500r/min离心15min后取适量上清液备测。1.4观察指标和方法1.4.1一般情况下包括精神状态、饮食、毛色、尿量及体重增长。1.4.2尿中微量白色排泄率采用胶体金双抗夹心法检测。1.4.3体重和肾重测量体重(BW)肾脏脏器系数(KW/BW)体重由电子秤测量,肾重由天平测量。根据公式肾脏脏器系数=双侧肾重/体重×100%计算。1.4.4肾组织蛋白检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,按照试剂盒说明书取肾脏组织匀浆测定,肾脏组织蛋白定量用考马斯亮兰法。1.4.5光镜下病理观察肾脏组织经10%的福尔马林固定约4h后,经过PBS缓冲液漂洗、逐级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡与包埋、切片和苏木素-伊红染色(HE染色)后,进行光镜下病理观察分析。1.5均数稳定性检验采用SPSS12.0统计软件对数据进行分析。数据以x¯±sx¯±s表示,均数间比较采用方差分析,两两比较时,方差齐性时用LSD检验。方差不齐时用DunnettT3检验。配对资料采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1执行stz钢绞线对正常大鼠肠道正常的影响NC组小鼠体重明显增加,精神状态良好,动作敏捷,毛色光泽,饮食与饮水正常,粪便正常。模型小鼠在腹腔组注射STZ72h后饮食及饮水量较正常鼠明显增加,而且精神萎缩,反应迟钝,活动度差,毛色差,尿量增多。治疗期间,DC组小鼠持续多饮、多食、多尿,精神倦怠,动作迟缓。各治疗组亦出现类似情况,但情况较轻。2.2体重、血糖和造模时总血糖比较造模后及给药8周后,糖尿病各组体重均比同期正常组减轻。造模后,糖尿病各组间体重无差异性;给药8周后,FLE各剂量组体重与模型对照组间无差异,但二甲双胍治疗组体重较模型对照组有显著差异性(P=0.023),可见FLE对小鼠体重无明显影响。造模后及给药8周后,各治疗组血糖均比同时期正常对照组高(P<0.05);造模后,各治疗组间血糖比较无差异性(P>0.05);8周后,模型对照组及FLE各剂量组血糖继续升高,与治疗前比较无差异性(P>0.05),但二甲双胍治疗组较试验前显著降低(P<0.05),见表1。2.3各组小鼠肝肾功能指标比较肾脏脏器系数及尿微量白蛋白排泄率的影响解剖小鼠取出双侧肾脏,放在滤纸上吸附,称重并计算肾脏脏器系数,结果见表2。糖尿病各组肾脏脏器指数均明显高于正常对照组,各治疗组肾脏重量均明显低于模型对照组(P<0.05);FLE中、高剂量组肾脏脏器系数明显低于模型对照组和二甲双胍治疗组(P<0.05),中、高剂量组肾脏系数平均下降11.1%和16.7%。糖尿病各组小鼠尿微量白蛋白排泄率均较正常对照组小鼠有明显升高(P<0.05)。FLE中、高剂量组小鼠的尿微量白蛋白排泄率低于模型对照组,差异均有显著性(P<0.05),FLE低剂量组及二甲双胍治疗组小鼠尿微量白蛋白排泄率较模型对照组有所降低,但差异无显著性(P>0.05)。2.4fle对肝肾sod、gsh-px活性的影响FLE对糖尿病小鼠肾脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响见表3。与正常对照组比较,模型对照组(DC)肾脏SOD、GSH-Px活性均降低,MDA含量增加(P<0.05)。与模型对照组(DC)相比较,FLE中、高剂量组及二甲双胍组的SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05),其中高剂量组SOD活性明显升高,与正常对照组水平接近。FLE各剂量组及二甲双胍治疗组MDA含量均明显低于模型对照组(P<0.05)。2.5亚木马酚素治疗后小鼠肝肾组织结构变化肾脏组织切片、HE染色后,光镜下可见糖尿病小鼠模型对照组肾小球数目增多,肾小球毛细血管壁狭窄甚至闭塞,并可见部分肾小管上皮细胞空泡变性。亚麻木酚素治疗后,各组肾小球基质及系膜细胞明显减少,血管绊开放。见图1～6(HE染色×400倍)。3抗氧化应激药物糖尿病肾脏病变是糖尿病的主要并发症之一,也是糖尿病患者重要的致残和致死原因。目前,1型糖尿病患者肾病患病率33%～40%,2型糖尿病患者肾病患病率在20%左右。中国住院糖尿病患者中,糖尿病肾病患病率约为33%,其中早期肾病18.0%,临床肾病13.2%,肾功能不全5.3%,尿毒症1.2%。糖尿病肾病己成为我国终末期肾功能衰竭的主要原因之一,患者最终只能依靠透析或肾移植来维持生命,给家庭和社会带来沉重的经济负担和精神压力。因此,如何防治糖尿病肾病己成为国内外肾病学者早就热切关注的课题。糖尿病肾病的病因及发病机制十分复杂,涉及遗传、代谢、生长因子、细胞因子等多种因素。Brownlee提出了糖尿病并发症的统一机制学说:高糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多,导致组织细胞发生氧化应激,最终导致糖尿病及其并发症的发生、发展过程。糖尿病时,血糖升高造成肾组织中化学性质活泼的反应氧产物(reactiveoxygenspecies,ROS),如过氧化氢(H2O”2)、超氧阴离子(O-2)和羟自由基(OH-)等产生过多,破坏肾组织正常的氧化/还原反应的动态平衡,造成肾组织的氧化应激状态。ROS通过激活蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)使转录因子核因子-kB(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)和活化蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)活化,使肾组织产生大量的细胞因子及生长因子,导致肾组织细胞破损、基质重构、纤维化和信号通路的异常,启动糖尿病肾病的发生,故氧化应激是糖尿病肾病的重要发病机制之一。具有抗氧化应激特性的药物的研究开发也成为防治糖尿病肾病的热点。他汀类药物、噻唑烷二酮类药物、ACEI/ARB类药物和α-硫辛酸有抗氧化效应,从而能起到延缓糖尿病肾病发生发展的作用,在临床得到广泛应用。近年发现膳食来源的活性物质-木酚素具有较强的抗氧化性,其具有抗氧化、预防糖尿病发生和保护肾脏的作用,与血清和胰腺脂质过氧化产物丙二醛水平及炎症细胞因子水平下降有关。但对于糖尿病肾病的治疗作用及机制少见报道。本实验使用亚麻木酚素提取物治疗糖尿病模型小鼠8周后,与模型对照组比较,虽然对无明显降低血糖作用,但能减少肾脏肥大指数及减轻肾脏病理变化,减少24h尿微量白蛋白排泄率;其肾脏保护作用在亚麻木酚素中、高剂量组中更具有显著性差异。肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜的增厚及系膜区的扩大是糖尿病肾脏病变早期的病理学改变,尿微量白蛋白排泄率是糖尿病早期肾脏损伤的一个重要特征。亚麻木酚素提取物未能显示出改善血糖的作用,提示其对糖尿病小鼠肾脏损伤的保护作用可能与二甲双胍的作用机制不同,不是通过糖代谢的调节而是通过改善高血糖诱导的生物活性物质的异常代谢来实现的,这与Aida等研究结论一致。对于亚麻木酚素是否具有降血糖作用还需进一步的研究明确。本实验中糖尿病小鼠肾脏抗氧化酶SOD、GSH-Px活性较正常对照组都有降低,这可能与高糖有密切关系。二甲双胍治疗组能降低血糖及提高抗氧化酶活性,亚麻木酚素提取物中、高剂量治疗组虽无明显降血糖作用,但抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明显升高,证实亚麻木酚素提取物具有显著的抗氧化应激作用。MDA是脂质过氧化的产