玉米大蒜茎尖培养研究

玉米大蒜茎尖培养研究

目前，有关于大蒜轮作栽培技术和提高生产力的报告，对大蒜组织培养的研究很多[3.7]。玉林大蒜是广西名优地方特色农产品,因其具有品质独特、香味浓郁、辣味强烈、蒜油丰富、衣泽紫红等优点,在市场上深受欢迎。大蒜是无性繁殖植物,由于农民常年自留种蒜,依靠鳞茎繁殖,使病毒通过蒜种逐年累积并代代相传,导致品种种性严重退化,严重制约了商品蒜生产的健康发展。本试验以广西地方优良品种玉林大蒜为材料,采用不同浓度激素进行调节,研究茎尖脱毒及再生繁殖技术,以期探索一套适合广西名优大蒜地方品种脱毒快繁的技术体系,为玉林大蒜脱毒组培苗的工厂化生产奠定基础。1材料和方法1.1蒜皮的消毒制备供试材料为玉林仁东大蒜。将大蒜鳞茎置于约4℃冰箱中进行催芽处理,45d后取出剥去蒜皮,用自来水冲洗干净后,先用75%酒精消毒30s,再放入0.1%HgCl2中消毒灭菌15min,然后用无菌水冲洗4~5次。在超净工作台的解剖镜下,剥去蒜瓣肉质鳞片,取0.1~1.0mm约带1~3个叶原基的大蒜鳞茎尖。1.2芽诱导培养基的培养将剥离的大蒜茎尖接种到以MS、B5为基本培养基、附加不同浓度6-BA和NAA的芽诱导培养基上,先进行暗培养7d,然后移置到温度±25℃、光强为2000~3000lx的条件下培养,每天光照16h。待长出绿色幼芽后,即转入增殖培养基进行扩大培养。以上培养基蔗糖为3%,琼脂为0.5%,pH约5.8。1.3脱毒效果检测以未脱病毒样品作对照,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行大蒜脱毒效果的检测。检测试剂盒为ADGEN的产品(K1180409)。2结果与分析2.1叶原基对茎尖毒性的影响切取不同大小的茎尖在同等条件下培养,结果表明,以0.1mm不带叶原基的茎尖进行培养,大部分茎尖褐变或干枯死亡;以1.0mm带有2~3个叶原基的茎尖进行培养,茎尖萌动早、长势快,成活率最高,但其脱毒率明显低于小茎尖;以0.5~0.6mm大小、带1~2个叶原基的茎尖进行培养,较为适宜,不仅出芽率与成活率高,脱毒率也高,脱毒效果较好。2.2培养基的诱导分化分别采用MS和B5两种不同基本培养基且添加1.0mg/L6-BA和0.1mg/LNAA进行茎尖芽诱导分化培养,结果表明(表1),接种的茎尖在MS和B5培养基中均可诱导分化出芽并成苗,以B5培养基的出芽率较高,为76.7%,并且1周可诱导出芽,10d后即可变绿成苗,幼苗形态健壮。相比之下,MS培养基的芽诱导迟2~3d,出芽率为61.7%,生长发育较B5培养基的慢。因此,玉林大蒜茎尖培养采用B5基本培养基较好。2.3不同浓度naa对芽诱导率的影响选用B5作为基本培养基,研究不同激素配比对茎尖芽诱导的影响,结果表明(表2),在不同激素组合中培养的茎尖均可诱导出芽;当6-BA浓度为1、1.5mg/L时,芽诱导率分别随着NAA浓度的增加而提高;当6-BA浓度增至2mg/L时,芽诱导率随着NAA浓度的增加而降低,其中以处理6(1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)和处理7(2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)诱导率最高,依次为96%和94%。从生长发育情况来看,处理6的茎尖出芽成苗早,苗形态健壮,叶色浓绿;处理7的幼苗较细长,长势较处理6的差。因此,在B5培养基中添加1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,芽诱导效果较佳,适合于大蒜茎尖芽诱导。2.4不同naa浓度对芽增值的影响将诱导的不定芽分别在含不同激素配比的B5培养基中培养,3d后不定芽开始膨大,4~5周后茎尖开始分化出丛芽,但不同激素组合的增殖效果不同(表3)。在一定6-BA浓度下,芽增值倍数随着NAA浓度的增加而降低,其中,处理1(0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA)的增殖倍数为4.5,增殖效果最佳,且新芽发育正常,继代2~3次后生长良好。因此,可选用B5+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA作为大蒜茎尖不定芽增殖的培养基。2.5潜隐病毒和洋葱黄矮病毒的检测随机抽取大蒜试管苗50份,以未脱病毒样品作对照,采用间接酶免疫吸附测定法进行大蒜普通潜隐病毒(GCLV)和洋葱黄矮病毒(OYDV)检测。其中,对大蒜普通潜隐病毒的检测中有92%样品呈阴性,对洋葱黄矮病毒的检测中有95%呈阴性,脱毒效果均达90%以上。3培养大蒜芽并成苗有资料显示,切取蒜瓣内幼芽的茎尖分生组织,经组织培养获得脱毒苗是解决大蒜品种退化、提高大蒜产量和质量的有效途径。本试验以广西名优地方大蒜品种—玉林大蒜鳞茎尖为外植体,研究外植体大小、不同培养基或激素组合对芽诱导与增殖的影响以及茎尖脱毒效果。试验结果表明,以B5为基本培养基、附加不同浓度6-BA和NAA,均可直接诱导出芽并成苗,芽初代诱导的适宜培养基为B5+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;不定芽增殖的适宜培养基为B5+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA。大蒜脱毒比率的高低直接取决于所剥离茎尖的大小,有研究表明,采用0.2~0.9mm的大蒜茎尖进行培养,可以获得无病的大蒜幼苗。在本研究中,0.1~0.2mm的茎尖脱毒效果好,但接种后难以成活;1.0mm左右的茎尖利于培养和扩繁,但难以保证脱毒效果。通过反复试验,选取剥离0.5~0.6mm带有1~2个叶原基的茎尖进行培养,可获得90%以上的脱毒率,脱毒效果较明显,但仍有10%左右的材料无法消除病毒,因此,脱毒方法需进一步研究与改进。此外,在继代增殖过程中发现部分材料在继代4~5次后,试管苗形成微鳞茎,蒜叶干枯死亡