丹参毛状根相关分子基因smmc1的克隆与表达分析

丹参毛状根相关分子基因smmc1的克隆与表达分析

嘴唇科的老鼠尾草植物。它的干燥根和根茎被用作丹参。它是目前治疗心脑血管疾病的主要中医药，年剂量超过20t。酚酸类化合物在鼠尾草属植物中广泛分布,在丹参中主要是丹参素、迷迭香酸、丹酚酸A,B,C等化合物,其中丹酚酸B的含量较高,药理作用明显,是丹参的特征化合物,2005年版药典已经将其作为丹参的检测指标之一。关于丹酚酸B生物合成途径的研究较多,其主要是通过苯丙氨酸和酪氨酸途径,由迷迭香酸与咖啡酸进一步缩合而成。应用丹参毛状根体系研究表明,酵母诱导子、茉莉酸甲酯和Ag+等诱导能够增加丹酚酸类化合物的积累量,上调苯丙氨酸和酪氨酸途径的关键酶基因,但是关于其上游基因的报道较少。分支酸是莽草酸代谢途径的终产物,是芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)、水杨酸、吲哚乙酸(IAA)的生物合成前体。植物中分支酸在分支酸变位酶(chorismatemutase,CM)催化作用下生成预苯酸,进一步脱羧基、脱水/氢,在氨基转移酶的作用下生成苯丙氨酸和酪氨酸,而苯丙氨酸和酪氨酸是丹参酚酸类化合物的合成前体。CM基因已经在拟南芥Arabidopsisthaliana,毛果杨Populustrichocarpa,玉米Zeamays等植物中被克隆得到,本研究应用RT-PCR技术从丹参中克隆得到1条分支酸变位酶全长cDNA,并采用实时荧光定量PCR检测其在根、茎和叶中的表达水平及酵母和银离子诱导后在丹参毛状根中的表达水平变化。1作者人格asrhizaf,alba丹参全株分别于2012年11月采自山东莱芜,经黄璐琦研究员鉴定为白花丹参Salviatiorrhizaf.alba,将根、茎和叶分别收集液氮速冻,-80℃保存。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。丹参毛状根,由丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根,用6,7-V培养基继代暗培养,培养18d用终浓度分别是30mmol·L-1Ag+和100g·L-1YE联合诱导,分别在诱导后0,4,8,12,24,36h采收,液氮速冻,-80℃保存。2方法2.1总rna的测定采用CTAB法提取丹参原植物根、茎、叶以及对照和处理毛状根总RNA,测定其浓度,选择A280/2601.8～2.0,A260/2301.8～2.0的总RNA1μg,应用Thermo反转录试剂盒,按照操作流程反转录成总cDNA。2.2pcr扩增及纯化从丹参毛状根的EST序列分析中发现1条具有完整开放阅读框的CM基因。利用PrimerPremier5软件设计引物Chori-F5′-CAAATGGAGGCGAAGCTGTTGAG-3′,Chori-R5′-CAATTTAATCGAGTCTTCTCAAAAGATAC-3′,以丹参总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为H2O15.4μL,dNTP1.6μL,ExTaqBuffer2.0μL,引物(10pmol·L-1)各0.4μL,ExTaq(5U·μL-1)0.2μL。扩增条件为95℃预变性5min;之后95℃30s,55℃30s,72℃1min循环30次,最后72℃延伸10min,4℃保温。PCR产物中加入1/5体积的loadingbuffer,1%琼脂糖凝胶电泳检测,1000bp处检测到清晰的目标条带。用胶纯化试剂盒纯化PCR产物,超纯水溶解,与pGEM-Teasy载体连接,连接成功后转化DH5α感受态细胞,并涂布在加氨苄青霉素的LB平板上,37℃过夜培养。挑取生长良好的单克隆斑点,在加氨苄青霉素的液体LB培养基中扩繁,PCR检测,选择阳性菌株送北京华大基因研究中心测序,得到全长cDNA序列,命名为SmCM1。2.3smcm1生物信息分析SmCM2.4pcr检测smcm1的表达反转录PCR(RT-PCR)采用TaKaRaExTaq酶,以丹参β-actin基因(GenBank:DQ243702;引物序列actinF5′-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3′,actinR5′-AGGAACCACCGATCCAGACA-3′)为内参,比较SmCM1在根茎叶中的表达量,其引物序列为SmCM1-F5′-AAGGATGCTCGTCAGG-3′,SmCM1-R5′-GCTACTCTTGGGTTGG-3′。分别取根茎叶cDNA,稀释10倍之后各取1μL,dNTP1.6μL,10×Buffer2.0μL,ExTaq酶0.1μL,正反引物各0.4μL,加ddH2O至20μL。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。qRT-PCR分析采用TaKaRaSYBRGreenPremix染料,以丹参β-actin基因为内标,检测SmCM1在YE+Ag+诱导丹参毛状根0,4,8,12,24,36h的表达变化。PCR体系为2×SYBRPremixTaqTM10μL,正反引物各0.4μL,ROXReferenceDyeII0.4μL,DNA模板2.0μL,加ddH2O至20μL。PCR程序为二步法,95℃预变性30s,然后95℃5s,60℃34s循环40次PCR扩增。该反应添加溶解曲线。每个样品设3个重复。3结果与讨论3.1玉米中同源性较高的蛋白质聚合酶系将PCR扩增得到的基因测序,进行BLAST分析,发现其与CM基因有较高的同源性,cDNA全长948bp,命名为SmCM1。ORFFinder预测结果显示,其具有完整的开放阅读框。Blast结果显示SmCM1与矮牵牛Petunia×hybrid的CM1具有70%相似性,与毛果杨Populustrichocarpa的CM具有64%相似性,与拟南芥CM1具有72%相似性。应用CDD数据库分析SmCM1发现,其75～141位具有CM_2超家族功能域(chorismatemutasetypeII)。InterProScan结构域预测表明,SmCM1具有CM型结构域,真核类型(IPR008238,PF01817)。ExpasyScanProsite保守位点预测结构表明该基因62～316位均为保守的Chorismate_mut_3型结构域序列,见图1。将SmCM1基因与Genbank中11个物种19种蛋白进行比对,应用MEGA4使用NJ法(bootstrap1000)构建系统进化树。SmCM1与矮牵牛CM1聚为一类,其次与拟南芥CM1和玉米的CM蛋白亲缘关系也比较近,见图2。在与SmCM1同源性较高的蛋白质中,在拟南芥中发现了3种CM,毛果杨、葡萄、矮牵牛、玉米、蒺藜状苜蓿和蓖麻中各发现2种。由图2可以看出玉米中的ZmCM2单独聚为一支。矮牵牛、葡萄、拟南芥、蒺藜状苜蓿、毛果杨和蓖麻中的CM2聚在一起。3种绿藻中的CM蛋白质BathycoccusprasinosCM,莱茵衣藻ChlamydomonasreinhardtiiCM,CoccomyxasubellipsoideaC-169CM聚为一小支。拟南芥、毛果杨和蒺藜状苜蓿的CM3同源性较高聚为一小支。SmCM1与矮牵牛等6种植物中的CM1聚在一起,其中同属禾本科的水稻和玉米CM1具有100%的同源性,与双子叶植物的唇形科丹参CM1、茄科矮牵牛的CM1等的同源性只有49%。说明CM变异率与物种的关联性不大,物种自身的CM变异率高于物种间的衍化。高等植物中为满足千差万别的芳香类化合物、黄酮、生物碱等在不同环境中的合成和变构,植物中可能存在异常复杂的调控机制,不同的CM蛋白可能在不同的植物器官、植物的发育和信号信号传导中以及不同环境胁迫中发挥着各自不同的生理功能。如在拟南芥中CM1基因在花器中的表达量最高,在茎、根和叶中的表达量甚微;CM2基因在根中得表达量最高,其次是茎和叶;而CM3基因主要分布在花器,但在根和茎中也有表达。CM1与CM3的活性受游离芳香族氨基酸的调节,游离色氨酸增加会上调它们的活性,苯丙氨酸和酪氨酸则会抑制其活性,而CM2的活性基本不受芳香族游离氨基酸的影响。GenBank数据库中蛋白序列号分别为:毛果杨PopulustrichocarpaCM1(PtCM1,EEF04217.1);葡萄VitisviniferaCM2(VvCM2,ACY29655.2);拟南芥ArabidopsisthalianaCM1(AtCM1,AEE77552.1);矮牵牛Petunia×hybridaCM1(Pe(hyCM1,ACI41889.1);丹参S.miltiorrhizaCM1(SmCM1);玉米ZeamaysCM1(ZmCM1,ACG35737.1);水稻OryzasativaJaponicaGroup(OsCM,BAD87142.1);拟南芥A.thalianaCM3(AtCM3,AEE34916.1);毛果杨P.trichocarpaCM3(PtCM3,EEF01190.1);蒺藜状苜蓿MedicagotruncatulaCM(MtCM,AES96926.1);BathycoccusprasinosCM(BpCM,CCO14575.1);莱茵衣藻ChlamydomonasreinhardtiiCM(CrCM,EDP00124.1);CoccomyxasubellipsoideaC-169(CsCM,EIE23707.1);矮牵牛P.×hybridaCM2(Pe×hyCM2,ACI41890.1);葡萄V.viniferaCM1(VvCM1,ACM45078.1);拟南芥A.thalianaCM2(AtCM2,AED91604.1);蒺藜状苜蓿M.truncatulaCM(MtCM2,XP_003588837.1);毛果杨P.trichocarpaCM(PtCM2,EEF02895.1);蓖麻RicinuscommunisCM(RcCM2,XP_002515429.1);玉米Z.maysCM(ZmCM2,NP_001130752.1)。3.2smcm1的结构表征应用ExPASyComputepI/Mw工具(/compute_pi/)预测,SmCM1的等电点为6.41,相对分子质量36.0kDa。信号肽分析结果表明SmCM1为非分泌蛋白,跨膜域分析结果表明为非膜蛋白。亚细胞定位结果表明SmCM1定位于质体或细胞质。使用CFSSP进行二级结构预测结果表明,SmCM1中α螺旋结构占72.5%,β折叠结构占38.3%,无规卷曲占13.3%。使用SwissModel进行蛋白质三级结构预测,用于建模的蛋白残基为76～330位,以人类ChorismatemutaseA链作为模板(PDB:1csmA)构建同源模型,同源序列相似性37.84%,通过SwissPDBViewer以绿色标注结构域的蛋白残基,见图3。3.3wolfpsctor-pcr检测实时荧光定量PCR分析结果显示,应用2-ΔΔCt相对表达量分析,SmCM1和Actin扩增效率基本相同。在丹参根茎叶中均有表达,在茎叶中的表达量较高,分别是根中表达量的1.8,2.8倍,见图4。WOLFPSORT和TargetP1.1Server亚细胞定位分析表明,该基因定位在叶绿体内膜或者细胞质中。RippertP研究发现虽然在细胞质中有分支酸变位酶的存在,但是在拟南芥叶片悬浮细胞中其下游的脱水酶和脱氢酶都定位在质体中,排除了苯丙氨酸和酪氨酸在细胞质中合成的可能性。那么定位于细胞质中的分支酸变位酶具有什么样的生理功能,在丹参及其毛状根中苯丙氨酸和酪氨酸是否也在质体合成需要进一步的试验验证。3.4dahps催化的磷酸烯醇式糖发酵对培养18d的丹参毛状根进行YE+Ag+诱导,分析SmCM1以及其上游的3-脱氧-D阿拉伯-庚酮酸-7-磷酸合酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate7-phosphatesynthase,DAHPS)和分支酸合酶基因在RNA水平的相对表达量,见图5。这3个关键酶基因在诱导后皆呈一致的上调趋势,诱导后4h表达量上调,诱导后8h达到表达高峰,分别是对照的4.8,9.8,7.9倍。之后下调,36h后回到对照水平。分支酸变位酶是催化分支酸合成苯丙苯胺酸和酪氨酸的的关键酶,但是从结合杆菌中研究发现细胞内的分支酸变位酶活性非常低,而且缺乏突出的活性残基,但是在加入DAHPS后其催化活性能增加100多倍,DAHPS催化磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸生成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸,是大量芳香类化合物合成的第一步。晶体结构分析显示由4个DAHPS亚基四聚体与CM不规格二聚体组合成一个酶复合体,具有锰离子和分支酸/预苯酸结合位点。分支酸合酶催化合成分支酸,从本文的研究结果看这3个关键酶基因在YE+Ag+诱导后协同表达,具有一致的变化趋势。根据文献真菌和酵母提取物刺激能够提高丹参毛状根中酚酸类化合物的含量,结合本研究结果YE+Ag+诱导后碳流经莽草酸和分支酸途径将糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物大量合成苯丙氨酸和酪氨酸,从而提高