中国近交系版纳微型猪

中国近交系版纳微型猪

1猪细胞内1,3-gt基因改造目前，在同异体移植中，体移植的严重不足，导致了不同移植的研究。猪因其器官在功能、形态、理化性质上与人类较为匹配而逐渐成为人异种移植的首选供体和研究开发的热点。但猪-人器官移植过程中,由α-Gal引发的宿主抗移植物(Hostversusgraft,HVG)超急期免疫排斥反应是猪器官成功用于临床移植必须克服的首要障碍。为此,一些研究者尝试着对猪细胞内α1,3-GT基因进行改造,以最大限度抑制其合成α-Gal的能力,如针对α1,3-GT基因的RNA干扰技术,反义核苷酸技术、基因敲除等。已有的研究表明,用于基因改造的猪应该遗传背景清楚、稳定,这样才能使被改造的目的基因既能高效表达,又能稳定遗传。由云南农业大学曾养志教授培育的中国近交系版纳微型猪具有近交系数高等优点,是改造猪α1,3-GT基因的理想实验动物。但到目前为止,版纳近交系微型猪α1,3-GT基因克隆的研究尚未见报道。本实验从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GTcDNA全长序列并克隆至pMD18-T载体测序,测序后的α1,3-GT基因定向克隆到质粒pEGFP-N1中,构建真核表达载体pEGFP-N1-GT。将pEGFP-N1-GT转染肺癌细胞A549,RT-PCR检测α1,3-GTmRNA的表达,直接免疫荧光法观察α-Gal表位在人细胞膜上的合成情况。2材料方法2.1材料表面2.1.1细胞培养和培养近交系版纳微型猪由四川大学华西医院移植免疫实验室提供,为云南大学曾养志教授培育。肺腺癌细胞株A549为本室保存,用含有15%新生小牛血清的RPMI1640培养基,于37℃、5%CO2的孵箱中培养。大肠杆菌JM109由本室保存。2.1.2单粒含巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒pEGFP-N1系Clontech产品,由四川大学华西基础医学与法医学院黄宁教授惠赠。2.1.3pcr和荧光素提取试验剂RPMI1640培养基和DMEM培养基为Gibco公司产品,脂质体转染试剂盒lipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品,质粒DNA小量抽提UltraPureTM试剂盒、olig-T以及RT-PCR引物由北京赛百盛公司提供,Biozol总RNA提取试剂盒为Invitrogen产品,M-MLV逆转录酶为Promega产品,高保真KOD-PlusDNApolymerase系TOYOBO公司产品,限制性核酸内切酶以及DNA连接试剂盒DNALigationKit均为Takara公司产品,DNA回收试剂盒为V-gene公司产品,荧光素标记的植物凝集素为Vector公司产品。荧光倒置显微镜为OlympusIX-71型。2.2方法2.2.1逆转录酶pcrm-mlv①取新鲜版纳微型猪肝脏组织50mg,迅速放入预先液氮预冷的研钵中,快速研磨至粉末,按Biozol总RNA提取操作手册提取肝组织总RNA,紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。②RT-PCR以提取的总RNA为模板,按照以下条件进行逆转录:OligT(0.33μg/mL)6μl,RNA3μl,ddH2O3μl,70℃5min,冰浴2min后,顺序加入M-MLV5×buffer5μl,dNTP(10Mm)1.25μl,ddH2O5μl,RNA酶抑制剂0.75μl,M-MLV逆转录酶1μl,42℃90min。α1,3-GT的PCR扩增:根据GenBank中猪α1,3-GT的CDS序列(NM213810)设计引物,F:5′-CCGGAATTCATGAATGTCAAAGGAAGAG-TG-3′,5′端引入限制性内切酶EcoRⅠ的酶切切位点(下划线表示),R:5′-CGGGGTACCTCAGATGTTATTTCTAACCAAATT-3′,5′段引入限制性内切酶KpnⅠ的酶切切位点(下划线表示)。以逆转录得到的cDNA为模板PCR扩增版纳微型猪α1,3-GT的全长序列,反应条件如下:94℃预变性2min,94℃30s,58℃30s,72℃2min,33个循环,72°后延伸10min。PCR产物用8g/L琼脂糖凝胶电泳检测。③约1.1kb的PCR产物经DNA纯化回收,常规T-A克隆至pMD18-T,经蓝白斑筛,挑取阳性克隆交由天泰公司测序。2.2.2质粒双酶切t-1,3-gt和pegfp-dna的制备将含全长1116bpα1,3-GT的pMD18-T-α1,3-GT质粒菌种解冻,挑取冰渣,于含有氨苄青霉素的LB培养皿上划板,37℃恒温箱培养16h,挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200r/min振荡培养过夜,按质粒提取试剂盒说明书抽提质粒pMD18-T-α1,3-GT。同法获取质粒pEGFP-N1。EcoRⅠ和KpnⅠ,37℃过夜双酶切质粒pMD18-T-α1,3-GT和pEGFP-N1。8g/L的TAE琼脂糖凝胶电泳pMD18-T-α1,3-GT双酶切产物,DNA回收试剂盒切胶回收约1.1kb的α1,3-GT基因片段。DNA回收试剂盒直接纯化回收pEGFP-N1的酶切后的骨架载体。将上述pMD18-T-α1,3-GT酶切回收产物与pEGFP-N1酶切后的骨架载体以α1,3-GT(mol)∶pEGFP-N1(mol)为3∶1的比例,按连接试剂盒操作说明,16℃连接过夜。取连接反应液10μl转化至感受态细胞JM109,用SOC培养液37℃恒温箱培养1h后,涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板,37℃过夜培养。挑取单菌落,于含50mg/L卡那霉素的LB培养液中,37℃恒温振荡培养过夜,用质粒抽提试剂盒抽提质粒。选用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,EcoRⅠ、KpnⅠ单酶切以及PCR方法鉴定pEGFP-N1-GT。2.2.3pegfp-n-gt-级配对、生长和提取细胞的制备在96孔板接种对数生长期细胞1.5×104个/孔,用不含抗生素但含15%小牛血清的DMEM培养基培养24h,至细胞铺满孔底95%时,用不含血清和抗生素的DMEM培养基洗两次。按每孔0.2μg质粒/0.5μl脂质体,用无血清无抗生素的DMEM培养基分别稀释脂质体和pEGFP-N1-GT质粒至25μl,室温5min。将稀释后的脂质体和质粒混合并轻柔混匀,室温静置20min。加入脂质体-DNA混合物50μl/孔,轻轻混匀。培养6h后向孔中加入等体积的含30%小牛血清的无抗生素DMEM培养基,24h后检测A549细胞上α-gal的合成。同法,相应扩大细胞接种量和质粒及脂质体的用量,在30cm2培养瓶中将pEGFP-N1-GT转染至A549,用于检测α1,3-GTmRNA的表达。2.2.4逆转录和荧光显微镜检测①转染细胞中α1,3-GTmRNA的表达:取上述30cm2培养瓶中转染的细胞,PBS洗两遍,3mMEDTA消化单层贴壁生长的A549细胞,按照BIzol总RNA提取操作方法,分别提取转染pEGFP-N1-GT表达载体和未转染表达载体的A549细胞的总RNA。紫外分光光度计测量260nm/280nm吸光度比值和8g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。以提取的总RNA为模板,按照2.2.1的方法逆转录得到α1,3-GT的cDNA。根据GenBank中猪α1,3-GT的序列(NM_213810)及内对照(人β-actin)的序列设计引物,F1:5′-TCAATGCTGCTTGTCTCA-3,R1:5′-TAAGTGCCTTCCCATA-3′(扩增300bp的α1,3-GT片段);F2:5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′,R2:5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′(扩增500bp的β-actin片段)。以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR反应,条件如下:94℃预变性2min,94℃30s,50℃30s,72℃2min,33个循环,72℃后延伸10min。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳检测。②转染细胞中α-Gal合成:植物凝集素(BS-IB4lectin)能和α-Gal特异性结合,故本实验采用荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4lectin),检测转染细胞中α-Gal的合成。取96孔板中转染pEGFP-N1-GT的A549细胞,PBS洗两次,加入用RPMI1640培养基按1∶50稀释后的FITC-lectin100μl,室温下避光孵育15min。PBS洗两遍,于倒置荧光显微镜下观察转染细胞中α-Gal的表达情况。未转染质粒的A549细胞为对照。3结果3.1总rna质量测定版纳微型猪肝脏总RNA电泳显示28S,18S,5S三条带清晰,260nm/280nm吸光度比值为1.92,表明提取的总RNA质量较好。RT-PCR产物经8g/L的TBE琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,从版纳微型猪肝脏中扩增出来的目的片段长约1.1kb,与预期大小相符(见图1)。3.2猪1,3-gt基因分析RT-PCR扩增出来的α1,3-GT基因产物经T-A克隆测序,结果表明BMIα1,3-GT基因全长1116bp,与GenBank中公布的小鼠、牛的α1,3-GT基因具有高度同源性,与普通猪α1,3-GTcDNA全长序列完全一致(见图2)。3.3pegfp-dna扩增pEGFP-N1-GT经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,电泳显示在4.7kb和1.1kb附近出现清晰的DNA条带;EcoRⅠ、KpnⅠ分别单酶切pEGFP-N1-GT均得到约5.8kb的DNA条带,与理论值吻合。同时以pEGFP-N1-GT重组质粒为模板,PCR扩增全长α1,3-GT,PCR产物电泳,在1.1kb位置出现清晰DNA条带。酶切和PCR两种方法鉴定结果均证明pEGFP-N1-GT真核表达载体构建成功(见图3)。3.4细胞中1,3-gtmrna的表达转染pEGFP-N1-GT的A549细胞中有α1,3-GTmRNA的表达,而未转染的人A549细胞无α1,3-GTmRNA的表达(见图4)。3.5t组未见-gal的表达荧光倒置显微镜下,可以观察到在瞬时转染pEGFP-N1-GT的A549细胞膜上,α-Gal有不同强度的表达。未转染pEGFP-N1-GT组未见α-Gal的表达(见图5)。(a)lightmicrographofnon-transfectedA549;(b)fluorescencemicrographofnon-transfectedA549;(c)lightmicrographoftransfectedA549;(d)fluorescencemicrographoftransfectedA5494-gt基因敲除猪目前,器官来源短缺严重阻碍了器官移植的临床推广。寻求能够代替人的供体动物已成为解决这一难题的新选择。猪因其器官与人器官在生理结构和生化功能上很相似、繁殖能力强、饲养方便、不涉及伦理学等优点被认为是异种器官移植的最佳供体动物。移植免疫学研究发现,在猪、小鼠等非灵长类哺乳动物体内存在着α-Gal表位,人由于负责合成α-Gal的α1,3-GT基因的缺失突变,不能合成这种表位,但在胃肠道表达α-Gal微生物的刺激下,人体内产生了大量的天然抗α-Gal抗体。当猪器官移植到人体后,人血清中天然存在的抗α-Gal抗体能迅速和猪细胞上的α-Gal结合,在数分钟内引发强烈的超急期免疫排斥反应(HAR)。过去的几年中,尝试用于克服HAR的方法有很多,如免疫吸附抗α-Gal抗体,阻断补体激活等,这些方法仅在一定程度上减缓了HAR的发生,并不能彻底消除HAR。从理论上讲,消除猪-人器官移植中HAR最理想的方法是培养出不表达α-Gal的猪。Lai和Kolber-Simondsl的研究小组,利用基因打靶技术将猪细胞α1,3-GT基因敲除,然后通过体细胞克隆技术,先后培育出了α1,3-GT基因杂合性敲除和纯合性敲除的猪,为α1,3-GT基因敲除猪用于异种器官移植提供了理想的动物实验研究模型。2005年,Schroeder等将人新鲜血液贯注GT纯合性敲除猪和GT+猪的肺脏,一系列生理学、组织化学方法用于评价贯注后的肺功能,结果发现GT敲除的猪肺功能持续时间为2h,而GT+的猪肺在贯注人血液后5min失去功能。活体动物实验也证实,将GT基因敲除的猪肾或心脏移植到狒狒(GT-/anti-Gal+)后,移植物的存活时间组明显延长。虽然α1,3-GT基因敲除的个体猪已培育成功,但要获得遗传稳定性好、数量能够满足临床需要的群体猪必须选择近交系猪体细胞作为敲除的对象。如果使用非近交系或近交系数不高的猪作α1,3-GT基因敲除,即便培育成功,也不能稳定遗传和快速繁殖扩大群体数量。由云南农业大学曾志教授培育的中国近交系版纳微型猪到2001年进入19世代,近交系数可达到98.3%,具有遗传背景清楚、基因高度稳定,一致的特点,非常适合作α1,3-GT基因敲除研究。然而,到目前为止,版纳近交系微型猪α1,3-GT基因的背景资料尚不清楚。本实验从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GTcDNA全长序列并克隆到pMD18-T载体,测序显示α1,3-GTcDNA全长1116bp,这一结果与GenBank中已经公布的小鼠和牛的α1,3-GT序列(NM_010283,NM_177511)具有高度的同源性,与猪α1,3-GTcDNA全长序列(NM_213810)完全一致。将克隆的版纳微型猪α1,3-GT基因构建成真核表达载体pEGFP-N1-GT,转染人肺腺癌细胞A549中。Marion等的研究表明,人α1,3-GT基因Ⅶ内含子中存在强转录终止信号,使得人α1,3-GTmRNA只转录出Ⅳ～Ⅶ外显子,导致人体中存在着截短的、无功能的α1,3-GT。因此,在本实验中,选择猪α1,3-GT基因第Ⅳ和第Ⅷ外显子区设计上下游引物以排除人