动物遗传质量的检测方法

动物遗传质量的检测方法

动物实验在医学的发展和进步中的作用是无法估量的。高接近杂交动物可减少实验动物和实验重复，提高实验结果的可比性、可重复性和准确性。近交系动物培育过程中,为保证实验动物基因的纯合性而辅之以遗传检测、及时发现和清除变异的个体是非常有必要的(RUssell,1993)。过去常用的检测手段包括性状基因检测、皮肤移植试验、生化标记检测等。随着分子遗传学技术的发展,遗传标记已经由形态遗传标记、细胞遗传标记、生化遗传标记扩展到分子水平上的遗传标记。1无品系间遗传污染近交系动物具有同基因性、遗传组成均一、长期遗传稳定性、个体性、背景资料和数据较完善等特点:①基因纯合性:在一个近交系内的所有动物的基因位点都应当是纯合子,在本品系内任何个体交配的后代也应当是纯合子,即基因型一致,遗传特性相同;②遗传物质同源性:是指同一个近交系中的所有个体在遗传上是同源的,可追溯到一对共同的祖先。同一品系内的个体间的皮肤或肿瘤移植不会被当作异已来排斥,各个体间的基因位点,及位点的分型是完全一致的;③表现型的一致性:近交系动物任何可遗传的体征都应是一致的,如生理、生化以及组织学、形态学上的特征(毛色、体重等)甚至行为的类型都趋于一致。由于近交系动物有以上优点,排除了一些对实验结果的不必要干扰。常常首选为哺乳动物遗传、发育、免疫机理、病理、药理学等方面诸多研究的理想材料,为人类疾病研究作出重要贡献。虽然在培育、保种和繁殖生产过程中,都有严格的要求,但由于影响遗传变异的因素很多,仍然存在着发生基因突变、遗传漂变或遗传污染等因素引起其遗传性的改变。对于新引进的动物,或新培育的品系,更需要摸清其遗传概貌。无品系间遗传污染是近交系动物的基本要求,是保证实验结果准确可靠的必要因素。因此,建立遗传质量监测手段,对确保近交系动物的遗传质量是必不可少的。2封闭式动物遗传质量检测方法2.1小鼠骨髓形态检测通常是指作为遗传检测用的形态学遗传标记,它主要利用易于检测的外部形态特征包括有毛色基因测试法和下颌骨测量法等方法。①毛色基因测试法:C.C.Little于1909年在杰克逊实验室首次进行了毛色遗传试验,此毛色观察一直是近交系质量的一个重要指标。毛色基因检测只能对少量与毛色有关的基因纯合与否进行检测,不能反映近交系的遗传概貌,难以检出其它位点的突变。②下颌骨形态测量法是基于小鼠骨骼形态具有高度遗传性和品系特异性,该标记已成为实验动物遗传背景监测常规方法之一。Greem早在1953年即在研究这方面的问题。现简介下颌骨分析法,20±1g小鼠的头骨经煮沸3min以上,并用胰酶于37℃消化24h后用清水洗净,取下颌骨置于L形直角座标板上测量不同骨性标志的长度和高度,将各测量点的值记入表中,计算后与标准置信区做比较,落在置信区内表示检验合格,落到置信区外的表示不合格。总的来说形态学的监测方法操作简便,费用低廉,不需要使用专门的仪器设备,实用性强,但精确度低。2.2染色体显色标记细胞学标记检测法即动物细胞染色体的变异,它包括染色体核型(染色体数目、结构、隋体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)的变化。与形态标记相比,细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育,难度很大。染色体显色法是一种细胞遗传学技术,可以利用鉴别C带和Q带作为染色体标记,用来区分大、小鼠的近交系。在多数大、小鼠的近交系,所有中期染色体都存在C带材料,同源染色体的C带区域大小相同;不同的近交系,C带材料大小不同,是品系特异的,是一种很有价值的检测亚系变异和混杂来源的方法。凌丽华等报道对T739小鼠及其亲本的C带染色体进行了研究,从C带的多态性证明了T739和615小鼠为近交系小鼠。2.3电泳检测系大小鼠的细胞纯度生化标记(biochemicalmarker)就是把一些易于用电泳的方法进行区分,遗传差异性明显的同工酶和同种异构蛋白进行比较。在各种近交系大小鼠中相当多的同工酶同种异构蛋白具有多态性。在近交系小鼠选择位于10个染色体上的13个生化位点,近交系大鼠选择9个生化位点,作为遗传检测的生化标记。目前常用的电泳方法是醋酸纤维薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺胶电泳等。将待检标本点样、电泳、显色。然后分析得到的电泳图谱,确定品系的遗传纯度,并可区分不同的品系,从而判断被检测品系的纯合程度。它具有检测的基因位点明确、方法简便快速、比较经济等优点,但存在精确度不高的缺点。2.4皮肤移植法检测h-2基因回复突变体的检测在近交系小鼠中发现了数目较多的遗传免疫标记,它们主要有细胞膜异源抗原和组织相容性抗原等。应用于近交系动物遗传监测的免疫学技术,一般包括混合淋巴细胞试验,H-2基因和多价抗血清反应,皮肤移植等方法。下面介绍皮肤移植法。Bailey和Usama在1960年首先提出皮肤移植法,是目前测定近交系遗传质量的重要方法之一。它是通过同系异体皮肤移植成功与否,来确定它们的组织相容性抗原是否同一。移植的部位有背部、耳部、尾部等。皮肤移植法是一种简便、准确性高、检测范围较广的方法。但其缺点,只能检测出近交系小鼠的基因是否一致,而不能测出各品系是否保持原有的遗传特性,需要观察较长时间。2.5pcr检测微卫星dna多态性的优势20世纪80年代以来,分子生物学技术与方法快速发展,已成为生物学、医学、农学等诸多领域非常重要和崭新的研究工具。分子生物学标记技术可以直接检验动物基因组核酸的改变,为近交系动物的遗传监测提供了直接客观的途径。分子生物学标记技术主要包括以下几类:2.5.1微卫星标记微卫星是以少数几个核苷酸(多数为2~4个)为单位多次串联重复的DNA序列,其多态性又称为简单序列多态性、短串联重复或简单序列长度多态性。微卫星的两侧一般为保守序列,据此可设计特异性引物,通过PCR扩增微卫星的等位基因。该序列广泛存在人及其他真核生物的基因组中,数量丰富,具有较多等位性变异和高度的个体特异性,容易检测,为共显性标记,且稳定可靠,实验重复性好,又经济。TaylorBA等运用PCR扩增近交系CAST/Ei小鼠的SSR,通过39个SSR变位就可检测CAST/Ei小鼠和普通小鼠常染色体的94%,实验结果显示微卫星标记是一个快速检测突变的方法。李军林等用微卫星技术对6个近交品系进行遗传质量监测,获得的带均为单条,结果表明,微卫星技术可以判定近交系小鼠是否遗传污染。欧阳兆和等研究微卫星DNA多态性在近交系小鼠遗传监测中的应用方法选取小鼠不同染色体上的16个微卫星位点,应用PCR技术对常用的10个近交系小鼠进行了微卫星DNA多态性分析结果14个微卫星DNA具有稳定扩增效果,在同一品系不同个体之间表现单态性;在不同品系之间表现多态性,结论运用所筛选的14个位点进行微卫星多态性分析,能够快速、经济地对近交系小鼠进行遗传监测。2.5.2随机扩增多态性DNA随机扩增DNA多态性(RAPD)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。利用随机合成的非特异性寡核苷酸引物(5~10bp)扩增基因组DNA来获得多态性DNA片段。RAPD客观反映了每个生物基因组之间的差异,其绝大多数符合孟德尔遗传规律。RAPD分析所用的引物没有生物种属之间的界限,且不必预先知道被分析的基因核苷酸序列。RAPD标记的稳定性和特异性均受到怀疑,但由于其操作简便、快捷、经济实用而且多态性检出率高。在小鼠中,RAPD标记被应用于分析群体间的遗传距离,并对其在基因连锁分析、基因图谱构建中应用可能性进行了探讨该技术用一个(有时用两个)。张文艳等用100个引物对BALB/c小鼠、C57BI.小鼠及KM小鼠进行样本扩增,几乎90%以上的引物得到扩增带,从中选出21个引物对3种小鼠组织样本扩增,有13个引物可区分BALB/c。和C57BL小鼠,8个引物可区分BALB/c和KM小鼠。单从毛色和外观上难以区分BALB/c和KM小鼠,而采用该法只需通过观察扩增带就能很好的区分。吴开平运用RAPD-PCR对小鼠进行遗传检测的可能性,筛选在各品系小鼠间具有多态性的引物。方法:运用40条引物对TA1、BALB/c、KM、NIH、SCID、T739、DBA/2、615、BALB/c-nu/nu等9个品系小鼠的NDA进行RAPD-PCR扩增,以琼指糖凝胶电泳观察结果。结果:40条引物中只筛选出2条多态性引物,其它38条引物扩增结果无品系间多态性。结论:RAPD-PCR方法可以区分9个品系的小鼠,是一种适宜于小鼠的遗传检测方法。RAPD技术在实验动物学研究中应用潜力很大,但缺点是RAPD指纹的重复性不高,各个实验室所产生的鉴别性RAPD遗传标记的可比性有待于提高。2.5.3AFLP标记扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,缩写AFLP)是1993年由荷兰科学家ZABEAU和VOS发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。它从原理上结合了RFLP和RAPD的优点,通过对基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性扩增而显示多态性。在AFLP反应中,酶切后的DNA片段被连上通用接头(Adapter)顺序作为PCR扩增的模板,这样接头顺序及其临近的酶切位点就成为扩增反应中引物的结合位点。选择性扩增的引物是在接头顺序和内切酶识别位点的基础上加一定数目(1~3个)的选择性碱基,只有那些与引物的选择性碱基严格配对的DNA片段才能被扩增出来。AFLP以其稳定性和较高的多态检出率而受到分子生物学家的关注,得到了广泛应用方法。吴丰春等应用AFLP技术对不同品系小鼠进行遗传检测研究,实验结果表明不同品系小鼠基因组DNA扩增结果存在差异,它也是一种适宜小鼠的遗传检测。2.5.4SNP标记SNP标记(singlenucleotidepolymorphism)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,有转换、颠换、插入缺失等形式引起。Petkov等选择了28个SNP,标记,这些标记覆盖了所有小鼠常染色体和X染色体,能区分所有的近交系小鼠,其结果显示该方法是一个快速、可靠及高效的遗传监测方法,这些SNP标记被用于随机监测已建立的群体中的所有种畜。SNP标记的发展极大地提高了鉴别近交系背景的能力。3生物学标记技术前四种是传统的监测手段是间接的遗传检测方法,它们主要是利用表型特征的变化来推测相应的基因变化为原理。上述表型特征作为遗传标记不同程度上存在精确度不高,易受外界环境因素影响,缺乏遗传稳定性,并且大多数标记无法覆盖近交系动物的全部染色体和基因位点,而且其中有些方法(如染色体分带技术和免疫遗传学标记)操作较复杂,对近交系动物遗传监测带来诸多不便。分子生物学标记技术本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。与表型标记相比,DNA分子标记技术具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受