父系遗传背景对小鼠超排效果及其孤雌胚胎体外发育的影响

父系遗传背景对小鼠超排效果及其孤雌胚胎体外发育的影响

影响母乳喂养的因素很多，包括卵母细胞的质量（ntess）。小鼠因为遗传背景清楚、来源方便经济、饲养条件容易控制等优点而成为动物克隆和ntESCs研究领域的重要试验动物模型。小鼠卵母细胞质量受到许多因素的影响,遗传品系即是一个不可忽视的重要因素,因此研究小鼠遗传品系对卵母细胞质量的影响,对动物克隆和建立ntESCs具有重要的理论意义。克隆动物的诞生以及胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESCs)所展现的巨大应用潜力,引发了克隆性治疗(Cloningtherapy)的研究热潮。克隆性治疗的目标是通过体细胞核移植(Somaticnucleartransfer)获得ESCs(ntESCs),虽然目前建立ntESCs的报道很多,但ntESCs分离建系效率仍然很低。自Wakayama等用B6D2F1卵母细胞作为卵胞质受体,首次克隆出体细胞核移植小鼠以来,这种遗传背景的小鼠卵母细胞已常用于克隆小鼠和建立ntESCs的研究,而其他品系的小鼠使用很少,其原因可能和遗传背景有关。但这种遗传优势来源于父本还是母本,目前尚未见有关的研究报道。本研究以不同近交系雄鼠与远交系昆明母鼠的杂交F1代小鼠为研究对象,以KM自交系为对照,比较了3种不同遗传背景的杂交小鼠与对照(KM自交系小鼠)的超排效果和孤雌胚胎体的体外激活率及其囊胚率,探讨这3种父系遗传背景对小鼠超排效果及卵母细胞孤雌胚胎体外发育的影响,以期为同类研究提供理论参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1李相运博士捐赠会6周龄以上成年昆明(KM)系雌鼠,质量25~28g,购自西安第四军医大学实验动物中心;6周龄以上成年129/Sv、C57BL/6J和C3H3种品系的雄鼠,质量25~28g,由河北农业大学李相运博士馈赠。试验组小鼠由129/Sv、C57BL/6J、C3H3种公鼠分别与KM系母鼠交配获得,即129/Sv×KM、C57BL/6J×KM、C3H×KM的F1代小鼠,对照组小鼠为KM×KM的F1代小鼠,均由西北农林科技大学动物科技学院国家干细胞工程技术研究中心自繁自养。小鼠在人工控温(22~24℃)和人工光照(7:00~20:00光照;20:00~7:00黑暗)条件下进行饲养,自由饮水、采食。小鼠饲料购自第四军医大学实验动物中心。1.1.2促性腺激素试剂培养液KSOM和体外操作液FHM均购自Chemicon公司,孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波第二激素制品有限公司,其他试剂均购自Sigma公司。1.2方法1.2.1小鼠红外受精神血工酶hcgfhm于18:00选择体重28~30g、发情前期的小鼠(不同遗传背景的小鼠每次2只),腹腔注射PMSG(6U/只),间隔48h后腹腔注射hCG(6U/只)。hCG注射后17h,颈部脱臼处死小鼠,手术取输卵管置于FHM操作液中,体视显微镜下用玻璃针刺破膨大部,释放卵丘-卵母细胞复合体(COC)。将COC在含1g/L透明质酸酶的FHM中作用3~5min,脱去颗粒细胞,用FHM洗3~4次,选择折光效果好、并且排除第一极体的卵置于KSOM培养液中,在体积分数5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养,以备用于统计卵母细胞和可用卵母细胞的数量。1.2.2-dmap对ksom的激活作用将卵母细胞用含2.5μg/mL离子酶素的FHM处理5min(室温条件下),FHM洗3~4次,再用含2.5mmol/L6-DMAP的KSOM在体积分数5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养4h,KSOM洗3~4次,最后用KSOM培养液在体积分数5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养。24h后观察卵裂情况,以卵裂作为卵母细胞激活的标志。第4天观察并记录囊胚发育情况。1.3数据的统计分析用χ2检验差异显著性,P<0.05为差异显著。2结果与分析2.1父系遗传背景对fps小鼠超排效果的影响由表1可见,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM组与KM×KM组间的排卵数量和可用卵数量差异不显著(P>0.05),说明129/Sv、C3H和C57BL/6J的父系遗传背景对F1代小鼠的超排效果没有影响。2.2小鼠卵母细胞激活率和囊胚发育率由表2可知,卵母细胞激活后48h,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM组与KM×KM组小鼠卵母细胞的激活率没有显著差异(P>0.05);129/Sv×KM组和C3H×KM组的囊胚发育率显著高于C57BL/6J×KM组和对照组(P<0.05),C57BL/6J×KM组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。说明129/Sv和C3H父系遗传背景不影响F1代孤雌胚胎的激活率,但对其囊胚发育率有一定影响。3父系和外交系小鼠超排、体外发育的影响本试验结果显示,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM组和对照组的排卵数及可用卵母细胞数之间没有显著差异(P>0.05);试验组之间及试验组与对照组之间激活率差异不显著(P>0.05);129/Sv×KM组和C3H×KM组父系遗传背景小鼠的囊胚发育率显著高于C57BL/6J×KM组和对照组(P<0.05),C57BL/6J×KM与对照组差异不显著(P>0.05)。超数排卵是外源激素参与排卵的过程,其效果不同程度地受小鼠品系、周龄、体重、激素剂量与处理程序的影响。不同品系小鼠超排效果的差异很大,有研究表明,远交系超排卵效果较近交系好,近交系之间杂交鼠的超排卵效果较近交系纯系小鼠好。但是这种差别来源于父系还是母系,至今尚未见相关报道。本研究结果显示,129/Sv、C3H和C57BL/6J父系遗传背景对F1代小鼠超排效果没有影响,提示上述超排效果的差异可能来自于母本。小鼠胚源性基因的表达是在Ⅱ细胞期,第一次卵裂主要由母源基因控制。Goddard等研究表明,母源遗传的发育信息在控制胚胎早期卵裂中发挥着重要作用。本研究结果还表明,3种近交系小鼠的父系遗传背景不影响F1代孤雌胚胎的激活率,同时也表明本研究所用的激活方法对卵母细胞的激活率没有影响。有研究发现,遗传背景影响体外受精胚胎的体外发育和胚胎干细胞的建系,如Orly等对129/Sv、C57BL/6J体外授精胚胎发育的研究发现,129/Sv的胚胎发育率显著高于C57BL/6J。李相运等研究发现,129/Sv胚胎干细胞的建系率,高于远交系小鼠KM和CD-1及近交系小鼠C57BL/6J。但关于小鼠不同遗传背景对孤雌胚胎体外发育影响的研究还未见报道。本试验结果发现,129/Sv×KM、C3H×KM的卵母细胞可促进孤雌胚胎的体外发育。129/Sv×KM卵母细胞的这种特性可能与129/Sv小鼠具有高频自发畸胎瘤的遗传背景有关;C3H虽没有高频自发畸胎瘤的遗传背景,但是具有自发乳腺癌的遗传背景,因此,C3H×KM的这种特性可能与C3H具有自发乳腺癌的遗传背景有关。也有研究发现,有些遗传背景的小鼠并不能提高胚胎的体内外发育能力。如Renard等研究发现,C57BL/6J×DDK的胚胎只有部分能发育到囊胚,显著低于DDK×DDK。本研究发现,C57BL/6J×KM也不能显著提高孤雌胚胎的体外发育能力,其原因还有待进一步研究。选择优质的卵母细胞,对提高克隆动物及建立ntESCs系的成功率具有重要意义。遗传背景是影响卵母细胞质量的一