棉花e-isj标记的多态性筛选及连锁图谱构建

棉花e-isj标记的多态性筛选及连锁图谱构建

棉花有四种种植类型：草地棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉。其中，陆地棉占世界棉花产量的95%以上，海岛棉占约2%。然而作为纺织工业原料陆地棉的纤维品质比海岛棉差。如何培育高产优质陆地棉品种一直是棉花育种的重要目标。棉花产量、纤维品质等性状为数量性状,传统遗传改良方法进展缓慢,效率低。DNA标记技术的研究进展为数量性状的遗传改良提供了快速有效的方法。在构建遗传连锁图谱和定位数量性状基因座的基础上,利用与QTL紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择,可大幅度提高育种效率。利用海陆种间杂交群体,已构建了相对饱和的棉花种间图谱。由于棉花种间杂交遗传连锁图谱难以用于陆地棉遗传改良,因此需要构建陆地棉饱和遗传连锁图谱。而陆地棉品种间的DNA标记多态性低,目前所构建遗传连锁图谱的标记密度、基因组覆盖率还不能满足分子标记辅助选择的需要,需要开发大量新型标记。Lin等和Zhang等相继将SRAP标记应用于棉花遗传连锁图谱的构建。郑靓等根据植物基因内含子-外显子剪接位点保守序列设计了扩增内含子的IT-ISJ,并将其应用于陆地棉遗传图谱构建。本研究利用不同ET-ISJ引物组合对陆地棉重组近交系群体进行标记基因型检测,构建遗传连锁图谱,以确定ET-ISJ标记在作物遗传连锁图谱构建中的应用价值。1材料和方法1.1fps3的种植2006年于西南大学重庆北碚歇马科研基地种植270个(渝棉1号×T586)F2:7重组近交系。采用改良的CTAB法提取渝棉1号、T586、F1、重组近交系幼叶DNA。1.2pcr产物的克隆测序参照郑靓等的方法设计扩增外显子的ET-ISJ引物。根据前体mRNA内含子-外显子剪接边界5端保守序列TGTGCAGGT作为正向引物的核心部分,以剪接边界3′端保守序列ACTTACCTG作为反向引物的核心部分,为保证引物的退火温度在55℃左右,同时为下一步进行PCR产物克隆测序,在正向引物5′端加上限制性内切酶EcoRI的识别序列GAATTC,在反向引物5′端加上限制性内切酶PstI的识别序列CTGCAG。正向引物与反向引物均在3端加上3个任意选择碱基(表1)。1.3pcr扩增et-1ET-ISJ标记扩增反应体系含1.0µL10×PCRbuffer、1.5µLMgCl2(25mmolL–1)、0.2µLdNTP(2mmolL–1)、0.5µL正向引物(10µmolL–1)、0.5µL反向引物(10µmolL–1)、0.1µLTaqDNA聚合酶(5UµL)、1.0µL模板DNA(50ngµL),以双蒸水补足10.0µL。扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性45s,53℃退火45s,72℃延伸1min,40个循环;72℃10min。采用银染方法检测ET-ISJ标记。命名标记以引物组合加一字母,如ET-ISJ18F58Ra,18F为正向引物,58R为反向引物,a表示一个引物组合产生多个位点中分子量较小的位点。1.4遗传标记分析采用JoinMap3.0作图软件,以LOD=4.0,重组率=0.4,Kosambi作图函数进行遗传连锁分析。根据已定位在染色体上的形态标记和SSR标记,确定ET-ISJ标记在染色体上的分布。采用绘图软件MapChart2.2绘制遗传连锁图谱。2结果与分析2.1多态性筛选的筛选利用1280对ET-ISJ引物组合,对陆地棉品种渝棉1号和T586进行多态性筛选,每个引物组合产生1~10个清晰条带(图1),片段为80~1000bp,其中69对引物在两亲本间具多态性,占5.4%。2.2ssr标记的遗传连锁分析以69对多态性ET-ISJ引物组合检测(渝棉1号×T586)F2:7重组近交系群体,获得70个标记位点(图2~图4)。其中62个表现显性,占88.6%;8个表现共显性,占11.4%。70个标记位点中有23个偏离1∶1的孟德尔分离比例(P≤0.05),占标记位点的32.9%。其中6个位点较严重偏离孟德尔分离比例(P≤0.001),占标记位点的8.7%。以70个ET-ISJ标记位点与523个SSR、59个IT-ISJ、29个SRAP和8个形态标记进行遗传连锁分析,构建的遗传连锁图谱包括59个连锁群、673个位点(68个ET-ISJ、510个SSR、58个IT-ISJ、29个SRAP和8个形态标记)(图5)。连锁图覆盖3216.7cM,占棉花基因组的72.3%,标记间平均距离为4.8cM。68个ET-ISJ标记分布于20条染色体(表2),其中第6、第8染色体均分布14个ET-ISJ标记。3群体遗传图谱扩增的可行性自Reinisch等将RFLP标记用于棉花遗传图谱构建以来,RFLP、AFLP、SSR和SRAP等标记已广泛用于棉花遗传图谱构建,但目前所构陆地棉遗传图谱覆盖率低,同时所定位的QTL与连锁标记距离偏远,不能满足分子标记辅助选择育种的需要。因此,需要开发大量新型标记,尤其是与基因紧密连锁的分子标记。作为基因翻译起始信号、前体mRNA加A位点、启动子、增强子区域和内含子-外显子剪接边界等保守区域均具有与基因紧密连锁的特性。此外,绝大多数植物基因都存在内含子,且内含子与外显子的结合区域高度保守。本研究根据前体mRNA内含子-外显子剪接边界保守序列设计的扩增外显子的ET-ISJ标记在陆地棉重组近交系群体亲本渝棉1号与T586间的多态性引物组合比例为5.4%,郑靓等设计的扩增内含子的IT-ISJ标记在渝棉1号与T586间的多态性引物组合比例为7.0%,SSR和SRAP标记在渝棉1号与T586间的多态性引物比例分别为6.8%和7.0%。ET-ISJ标记的多态性引物比例略低于IT-ISJ、SSR和SRAP标记。在这些标记中,SSR标记稳定性好,但正向引物与反向引物不能任意组合,成本较高;ET-ISJ、IT-ISJ和SRAP标记正向引物与反向引物可任意组合,成本较低;SRAP标记扩增程序退火稳定较低(前5个循环35℃),易产生非特异性扩增产物;ET-ISJ和IT-ISJ标记具有结果稳定与成本低的优点。扩增外显子的ET-ISJ标记对构建陆地棉高密度遗传图谱和QTL定位研究具有较好的应用前景。为确定扩增片段是否为外显子,下一步将对ET-ISJ引物组合扩增产物进行克隆测序研究。本研究表明ET-ISJ标记主要表现为显性。70个标记位点中有23个(32.9%)位点偏离1∶1的孟德尔分离比例(P≤0.05),6个(8.7%)位点严重偏离孟德尔分离比例(P≤0.001)。Zheng等研究指出,在同一群体,SSR与IT-ISJ标记的偏分离比例分别为30.7%和44.8%,严重偏分离比例分别为5.3%和13.8%。ET-ISJ标记偏分离比例与SSR标记一致,大多数偏分离标记集中分布于少数染色体区域。本研究还表明ET-ISJ标记总体上均匀分布于棉花基因组,但存在ET-ISJ标记密集区域。如第6和8染色体均具有14个ET-ISJ标记,第6染色体上SSR、IT-ISJ和SRAP标记密集,第8染色体上SSR和IT-ISJ标记密集。产生标记密集区域的可能原因,一是目前所开发的标记不完全均匀分布于棉花基因组;二是本研究使用的群体亲本在标记密集区域存在较大的DNA序列差异;三是棉花基因在基因组中分布不均匀,存在基因密集区域。本研究使用了SRAP、IT-ISJ和ET-ISJ三种基因相关标记,但这3