第十四章 基因工程和蛋白质工程简介

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生物化学第十四章基因工程和蛋白质工程简介

湖北工业大学生物工程学院食品工程系第十四章基因工程和蛋白质工程简介

主要内容第一节DNA重组与基因工程第二节蛋白质工程简介第三节核酸研究技术简介第一节DNA重组和基因工程

基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、DNA重组的技术路线二、基因工程的应用与前景三、DNA体外重组常用的酶DNA重组的技术路线

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscontainingarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制备

2、载体的构建

3、目的基因与载体的重组

4、重组体导入宿主细胞进行扩增

5、克隆基因的鉴定Ti质粒结构植物冠瘿瘤pBR322质粒的结构

以

噬菌体为载体进行DNA克隆

DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的

噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程

噬菌体感染大肠杆菌的途径

DNA重组体的筛选

载体特征的直接筛选

菌落的原位杂交

免疫学方法pBR322质粒结构

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活原位杂交法筛选DNA重组体图解复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographyDNA重组技术的应用

(1)开辟生物学研究的新纪元

反向生物学（invesebiology）的诞生（2）促进生物技术产业的兴起

基因药物基因诊断和治疗

转基因动植物胰岛素原的人工合成

胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原Ti质粒为载体的植物基因工程

I二元载体系统II共整合载体IIIT-DNA的转移与整合Ti辅助质粒Ti辅助DNA给体质粒Ti辅助DNA给体质粒pBR型质粒（给体质粒）宿主特异性外源基因宿主特异性整合带有外源基因的Ti质粒植物DNATi质粒转移并插入植物DNA第二节蛋白质工程简介

蛋白质技术和核酸技术的相互增强

在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。生物酶工程示意图

酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶

新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体转化寄主细胞推导出AA顺序制备合成肽制备对所编码蛋白专一的抗体基因或cDNA蛋白质蛋白质测定出AA顺序合成cDNA探针制备专一的抗体沉淀核糖体分离mRNA用Southern印迹法筛选DNA文库基因或cDNA第三节核酸研究技术简介一、DNA序列测定二、基因文库与cDNA文库三、聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）DNA测序的基本战略

设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。

酶法

化学法

测序技术进展酶法序列分析的原理

酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger测序法

(酶法)

读出模板互补序列dNTP

凝胶电泳

较大片段

较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反应混合物Klenow酶

未知序列的单链DNA

读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´

放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件DNA的化学测序示意图

反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼测序技术进展

同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳

多色荧光标记毛细管电泳

单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T引物标记法测序(DyePrimer)

一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP