第九章 原核生物转录调控

一、原核生物基因表达调控总论二、乳糖操纵元三、半乳糖操纵元四、色氨酸操纵元第九章：原核生物基因表达调控一、原核生物基因表达调控总论原核生物是单细胞生物，与外界环境密切相关。它们必须不断地调整各种不同基因的表达以适应营养条件和应付各种不利的物理化学因素。基因表达的调控主要发生在转录水平上，在其它水平上也常出现各种不同的调控方式。原核生物基因调控一般执行如下规律•一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。•基因的开与关是相对的。•开-关的活性可以通过转录水平上进行调节。•原核生物主要受到营养状况和环境因素的影响•真核生物主要是受发育阶段和激素水平的影响一、原核生物基因表达调控总论基因表达调控主要表现在二个方面•转录水平上的调控•转录后水平上的调控一、原核生物基因表达调控总论几个概念和要点：转录转录起始、延伸和终止

E.coliRNA聚合酶σ因子

启动子-10、-35序列启动子效率操纵子

一、原核生物基因表达调控总论转录：以DNA为模板的RNA的酶促合成。转录由RNA聚合酶催化，需要双链DNA模板与前体核糖核苷酸（ATP、GTP、CTP和UTP）。合成方向：5’－3’。模板链称为反义链。RNA聚合酶（RNApolymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。

催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶。如大肠杆菌的RNA聚合酶有五个亚基组成，含有α，β，β’，σ

，等4种不同的多肽，其中α为两个分子，所以全酶（holoenzyme）的组成是α2ββ’σ

。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心（α2ββ’）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点；σ因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，δ因子的作用就是识别转录的起始位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。

一、原核生物基因表达调控总论细菌的RNA聚合酶活性形式(全酶)为15S，由5种不同的多肽链构成，按分子量大小排列分别为β‘，β，σ，α和ω。每分子RNA聚合酶除有两个α亚基外，其余亚基均只有一个，故全酶为β’βα2σω。

α亚基：与启动子结合有关。β亚基：与转录的起始和延伸有关。β’亚基：与模板DNA的结合有关。一、原核生物基因表达调控总论

因子的结合和解离

因子的作用•

因子在酶与启动子结合的过程中起重要作用：①提高酶辨认启动子的能力；②降低酶与DNA的非特异性结合；③促进DNA开链；④提高RNA链合成起始的速度；⑤阻止酶分子聚合。全酶(holoenzyme)

核心酶(coreenzyme)

转录起始需解决的问题：1.RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。2.DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。启动子与转录起始5´pppG53

35RNA-pol启动子是一段位于结构基因5‘端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布期运动中的随机碰撞高100倍。

启动子与转录起始启动子：含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。长约40bp,内含对于启动子功能很关键的高度保守的短序列。

－10区（Pribnow盒）

:是几乎所有启动子都含有的一个6~8bp的序列，位于转录起点上游10bp处，一般为TATAAT。

－35区：是另一个在大多数启动子中都可找到的6~10bp序列（TTGACA）。位于转录起始点上游35bp处。启动子与转录起始•转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲合力，从而影响基因的表达水平。-10区与-35区的最佳间距•-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动子-10和-35区之间的间隔为17±1bp增大或减小能明显影响启动子强度。启动子与转录起始启动子有强弱之分，虽然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA的合成，但它却不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。

启动子与转录起始增强子可以提高转录的水平增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。例如，人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子作用下可提高600～1000倍。增强子的作用同增强子的取向(5’-3’或3’-5’)无关，甚至远离靶基因达几千kb也仍有增强作用。增强子1981年Benerji在SV40DNA中发现一个长约140bp的序列，它能大大提高SV40DNA／兔β—血红蛋白融合基因的表达水平，这是发现的第一个增强子。它位于SV40早期基因的上游，由两个正向重复序列组成，每个长72bp。目前发现的增强子多半是重复序列，一般长50bp，通常有一个8-12bp组成的“核心”序列，如SV40增强子的核心序列是5’—GGTGTGGAAAG—3’。

增强子首先被发现的增强子是SV40增强子。两个增强子位于基因组的两个串连的72nbp重复中，约在转录起始点上游200bp处，每个72bp重复中有一个。缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，而如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将β珠蛋白基因放在含有72bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72bp顺序位于离转录起点上游1400bp或下游3000bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG

增强子RNA聚合酶全酶(

2)与模板结合

2.DNA双链解开3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物5

-pppG-OH+

NTP

5

-pppGpN-OH3

+ppi转录起始复合物:RNApol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

启动子与转录起始RNA聚合酶与启动子的相互作用(1)DNA解旋：在RNA聚合酶的作用下，约有17bp的DNA解旋，形成一个开放的复合物，许多启动子中负超螺旋DNA可增强DNA解旋。(2)启动子区的识别•RNA聚合酶首先与非特异性结合位点相结合，形成过渡中间体，这种结合促进了酶向启动子移动，最终达到特异性结合，也称为扫描式。启动子与转录起始(3)酶与启动子的结合

•RNA聚合酶与启动子区结合，形成二元复合物，

然后开始合成RNA，形成三元复合物。

二元复合物=RNA酶+DNA

三元复合物=RNA酶+DNA+RNA

三元起始复合物：为全酶、模板DNA和新生RNA形成的复合物，亦可理解为由全酶、DNA和核苷三磷酸(NTP)构成。于RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子后形成。

复合物中的核苷三磷酸一般为GTP，少数为ATP，因而原始转录产物的5′端通常为三磷酸鸟苷（pppG）或腺苷三磷酸（pppA）。启动子与转录起始启动子与转录起始(4)RNA链起始：RNA合成无需引物，最初的9个核苷酸是在RNA聚合酶不沿DNA链移动或因子存在时合成的。RNA聚合酶首先要经过多次无效的链起始，在成功起始后因子释放出来。

第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3′-5′磷酸二酯键后，则启动阶段结束，进入延伸阶段。转录延长σ亚基脱离酶分子，留下的核心酶与DNA的结合变松，因而较容易继续往前移动。核心酶无模板专一性，能转录模板上的任何顺序，包括在转录后加工时待切除的居间顺序。脱离核心酶的σ亚基还可与另外的核心酶结合，参与另一转录过程。随着转录不断延伸，DNA双链顺次地被打开，并接受新来的碱基配对(DNA-RNA)，合成新的磷酸二酯键后，核心酶向前移去，已使用过的模板重新关闭起来，恢复原来的双链结构。一般合成的RNA链对DNA模板具有高度的忠实性。RNA合成的速度，原核为25～50个核苷酸／秒，真核为45～100个核苷酸／秒。

转录延长

亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，沿着DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP

(NMP)n+1

+PPi转录终止RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。

在原核中，发现终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。这种提供终止信号的结构就称为终止子。终止子可分为两类:1、不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用。2、依赖蛋白辅因子才能实现终止作用。这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称ρ因子。两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列，回文序列的两个重复部分(每个7～20bp)由几个不重复的核苷节段隔开。回文序列的对称轴一般距转录终止点16～24bp。两类终止子的不同点是：不依赖ρ因子的终止子的回文序列中富含GC碱基对，在回文序列的下游方向又常有6～8个AT碱基对(在模板链上为A、在mRNA上为U)；而依赖ρ因子终止子中回文序列的GC对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特征，其AT对含量比前一种终止子低。

转录终止5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

UUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构茎环结构使转录终止的机理使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。转录终止操纵元原核生物一个转录单元可视为一个转录单位，称为操纵元(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。

5

3

3

5

结构基因调控序列RNA-pol与RNA聚合酶结合启动基因转录的DNA序列为启动子(promoter)。•法国Jacob和Monod等人1961年提出乳糖操纵元(lacoperon)学说。•大肠杆菌能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况，是通过乳糖操纵元的调控而实现的，这是人们第一次开始认识基因表达调控的分子机理。•是属于可诱导操纵元(inducibleoperon)，这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。二、乳糖操纵元乳糖操纵元与负控诱导系统LacZ：编码β－半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖；LacY：编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁；LacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶。

乳糖(lac)操纵元的表达调控

在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，Ⅰ基因表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透性酶生成（本底表达）。乳糖(lac)操纵元的表达调控

当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透性酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子增加1000倍。正调控（positiveregulation）和负调控（negativeregulation）

诱导物与蛋白质结合形成激活子复合物，激活子复合物与基因启动子DNA序列结合，激活基因启动转录，称为正调控。

阻遏蛋白分子与基因启动子DNA序列结合，阻碍RNA聚合酶的工作，使基因处于关闭状态，称为负调控。

乳糖(lac)操纵元的表达调控乳糖操纵元的正调控

在细菌细胞内，ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环式AMP(cyclicadnosinemonophosphate,cAMP)。细胞内一种代谢激活蛋白(cataboliteactivatingprotein,CAP)是cAMP的受体蛋白(cyclicAmpreceptorprotein,CRP)。cAMP与CAP结合，形成cAMP-CAP复合物。cAMP-CAP复合物是乳糖操纵元的正调控因子。

乳糖(lac)操纵元的表达调控cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。cAMP与CAP结合形成激活子复合物，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。

当cAMP-CAP复合物与乳糖操纵元的启动子(o)的结合，使启动子区域的DNA序列构型变化，这种新构型有利于提高RNA聚合酶的工作效率。乳糖(lac)操纵元的表达调控CAP的正性调控当细胞中既有别乳糖与