华支睾吸虫胞囊蚴生物学作用的实验观察

华支睾吸虫胞囊蚴生物学作用的实验观察证实华支睾吸虫胞囊蚴是否具有无性生殖生物学作用。方法在非流行区捕获麦穗鱼，经10尾检查证实为阴性后，作为实验用鱼；华支睾吸虫尾蚴由中山大学中山医学院寄生虫学教研室提供。分A、B组作尾蚴定量感染，两次实验相隔30d。A组将30尾麦穗鱼放在容积为50cm×30cm×40cm的玻璃鱼缸内，11d内先后放入282条尾蚴感染麦穗鱼；B组用34尾麦穗鱼，分别将每尾鱼单独放在盛有300ml水的玻杯中，各放入30条尾蚴感染麦穗鱼；感染后的麦穗鱼均在阳台上饲养待查。同时采用直接压片和捣碎水洗沉淀法检查囊蚴。结果A组实验感染麦穗鱼30尾，丢失1尾，其余29尾感染率为100.00%；共检出囊蚴587个，是感染尾蚴数282条的2.08倍。B组实验感染麦穗鱼34尾，丢失3尾，其余31尾感染率为77.42%；共检出囊蚴1024个，其中有1尾麦穗鱼检出囊蚴968个，是感染尾蚴数30条的32.27倍。A、B组检出囊蚴数的G值分别为5.84、2.53。感染率与感染度，其间差异有统计学意义（P＜0.01、0.05）。探讨发生无性生殖的方式，认为有两种即：“囊蚴内繁殖”和“囊蚴外繁殖”；无性生殖种原来源于囊蚴内具有生物活性的游离颗粒。结论初步证实华支睾吸虫在第二中间宿主麦穗鱼体内，有第二次无性生殖过程，胞囊蚴具有无性生殖的生物学作用。华支睾吸虫在自然界完成生活史的过程中，宿主间转换传播动力比，终末宿主和第一中间宿主的变化规律基本保持一致，而第二中间宿主在转换寄生过程中，传播动力不仅未减弱还成倍增加[1]。形成这一生物学规律的原因，目前认为与第一中间宿主无性生殖作用尾蚴数量多有关。近年研究发现麦穗鱼体内有胞囊蚴的存在[2]，如果能够证实华支睾吸虫胞囊蚴，具有无性生殖的生物学作用，诠释这一现象更贴切。据此，2009-08以来，作者进行了麦穗鱼定量感染华支睾吸虫尾蚴的实验观察，发现在麦穗鱼体内有第二次无性生殖过程，现将观察结果报告于后。1材料与方法1.1华支睾吸虫尾蚴与阴性麦穗鱼来源华支睾吸虫尾蚴由中山大学中山医学院寄生虫学教研室华支睾吸虫生活史实验室提供[3]。麦穗鱼采自华支睾吸虫病非流行区的重庆市涪陵区镇安镇庄子村五社一水塘，并经10尾麦穗鱼捣碎水洗沉淀法检查，证实该水塘的麦穗鱼为华支睾吸虫囊蚴感染阴性鱼，作为此次实验观察感染用麦穗鱼。1.2实验分组与尾蚴感染方法实验观察分A、B组作尾蚴定量感染，两次实验相隔30d。①整群麦穗鱼定量尾蚴感染组（A组），将30尾麦穗鱼放在容积为50cm×30cm×40cm有水草生长的玻璃鱼缸内静养7d，然后于2009-08-17/28期间，先后在解剖镜下分批计数282条尾蚴放入鱼缸内，让其自然感染麦穗鱼。该组计算感染日龄起始时间为2009-08-28。②单尾麦穗鱼定量尾蚴感染组（B组），实验用麦穗鱼于2009-09-17送达广州，当天开始感染尾蚴。分别将每一尾麦穗鱼放在盛有300ml水的玻杯中，于17、18日在解剖镜下计数30条尾蚴放入各玻杯中感染麦穗鱼。为防止麦穗鱼跳出，玻杯上盖有带孔的盖子。尾蚴放入玻杯9h后，将被感染的麦穗鱼取出放在塑料桶内集中饲养。该组计算感染日龄起始时间为2009-09-18。实验结束3d后将A、B组感染的麦穗鱼带回涪陵，分组分别放入65cm×35cm×40cm容器内，在阳台上饲养待查。1.3麦穗鱼感染囊蚴检查方法与图片采集对每一尾麦穗鱼先将鱼肉直接压片在10×10生物显微镜下检查；然后收集直接压片检查过的鱼肉，与鱼头、鱼肠内容物一起捣碎水洗沉淀，保留适量沉渣，分次在4×10生物显微镜下检查。分别记录两种检查方法检出的华支睾吸虫囊蚴数，以某一方法检出最多的囊蚴数，为该尾麦穗鱼检出的囊蚴数。依据鱼鳞片上鱼龄线结合鱼体大小，确认为2009年当年生的麦穗鱼；早于2009年出生的麦穗鱼视为非当年生麦穗鱼。对A组、B组感染囊蚴数低于10个、30个的麦穗鱼，计算尾蚴感染成功率；感染囊蚴数高于10个、30个的麦穗鱼，视为发生无性生殖的麦穗鱼。囊蚴活动度下降，囊壁界线不整齐，排泄囊颜色特深颗粒粗大视为衰老囊蚴；囊蚴无活动，排泄囊散乱颜色变淡，视为死亡囊蚴。采用重庆光学仪器厂生产的XST－1型三筒生物显微镜对麦穗鱼进行检查。在显微镜正上方的镜筒口，装上广州市明美科技有限公司生产的130万像素MD－10显微摄像头，与计算机连接摄制囊蚴照片保存备用。1.4统计分析采用SPSS12.0统计分析软件，对组间囊蚴感染率比较，计算Pearson值；组间麦穗鱼华支睾吸虫囊蚴感染度，计算G值并作t检验分析。2结果2.1麦穗鱼感染率与感染度此次实验观察的2组麦穗鱼，先后于2009-12-14/2010-05-14完成华支睾吸虫囊蚴感染率与感染度检查。A组实验感染麦穗鱼30尾，丢失1尾，其余29尾均检出有华支睾吸虫囊蚴感染，感染率为100.00%；B组实验感染麦穗鱼34尾，丢失3尾，其余31尾中24尾检出华支睾吸虫囊蚴，感染率为77.42%；A组和B组华支睾吸虫囊蚴感染率差异有统计学意义（＝7.41，P＜0.01）。A组检出华支睾吸虫囊蚴的29尾麦穗鱼中，检出1～9个囊蚴有22尾，检出14个囊蚴有2尾，检出13、15、23、127、290个囊蚴的各有1尾；共计检出囊蚴587个，是感染尾蚴数282条的2.08倍。囊蚴数最多的2尾感染日龄分别为98d、211d。B组检出华支睾吸虫囊蚴的24尾麦穗鱼中，检出1、2个囊蚴各有8尾，检出3个囊蚴有3尾，检出4、5、6、8、968个囊蚴的各有1尾，总共检出囊蚴数为1024个。检出968个囊蚴的1尾，是感染尾蚴数30条的32.27倍；感染日龄为234d。A、B组检出囊蚴数的G值分别为5.84、2.53，其差异有统计学意义（t＝2.23，P＜0.05）。2.2当年生与非当年生麦穗鱼感染率与感染度两组实验观察，当年生麦穗鱼华支睾吸虫囊蚴感染率为100.00%（18/18），非当年生麦穗鱼华支睾吸虫囊蚴感染率为83.33%（35/42）,感染率差异无统计学意义（＝3.40，P＞0.05）。当年生与非当年生麦穗鱼检出囊蚴数的G值分别为6.79个、3.07个,其差异有统计学意义（t＝2.03，P＜0.05）。2.3尾蚴感染成功率A组平均每尾麦穗鱼感染尾蚴不足10条，29尾麦穗鱼中有7尾超过10个囊蚴，其余22尾麦穗鱼平均尾蚴感染成功率为54.09%（119/220），单尾在4.55%～40.91%之间。B组麦穗鱼检出囊蚴数超过30个的有1尾，其余30尾麦穗鱼平均尾蚴感染成功率为6.22%（56/900），单尾在0.00%～26.67%之间；尾蚴总体感染成功率A组和B组间差异有统计学意义（＝307.27，P＜0.001）。实验观察无性生殖发生率为13.33%（8/60）。2.4感染日龄华支睾吸虫囊蚴衰亡比在麦穗鱼感染华支睾吸虫囊蚴检查过程中发现，随着检查时间向后推移，出现衰亡华支睾吸虫囊蚴比有增高的趋势（表1）。3讨论3.1华支睾吸虫胞囊蚴生物学作用的确认生物学界公认的华支睾吸虫生活史中，只有在第一中间宿主淡水螺体内有无性生殖过程，近年发现华支睾吸虫在第二中间宿主麦穗鱼体内有胞囊蚴的存在[2]，弄清胞囊蚴的生物学作用，具有十分重要的意义。关于麦穗鱼定量感染华支睾吸虫尾蚴的实验很少报道，吴国宏等[4]用麦穗鱼定量感染尾蚴实验，只报告了成功感染率为15.21%～50.00%，而未报告检获的囊蚴数。此次实验观察A组在30尾麦穗鱼中放入华支睾吸虫尾蚴282条，而却在现存的29尾麦穗鱼中检出囊蚴587个，是感染尾蚴数的2.08倍；B组中有1尾麦穗鱼感染尾蚴30条却检出囊蚴968个，是感染尾蚴数的32.27倍。两次实验相隔30d，在不同时间采用不同实验方法进行的A、B两组实验，均获得了检出的囊蚴数是感染尾蚴数的数倍相同结果；同时此次实验检出的胞囊蚴（图1-Ⅴ）与以往报告的胞囊蚴（图1-Ⅵ）形态相近[2]，证实实验结果有很好的重现性。据此，此次实验结果，首次证实华支睾吸虫在第二中间宿主麦穗鱼体内，有第二次无性生殖过程，胞囊蚴具有无性生殖的生物学作用。3.2华支睾吸虫无性生殖方式探讨华支睾吸虫尾蚴进入麦穗鱼体内后，无法观察到整个生长发育形态的变化过程，能够观察到的只是某一时点的现状。根据目前收集到的观察资料，华支睾吸虫在第二中间宿主麦穗鱼体内进行无性生殖的方式可能有2种，即“囊蚴内繁殖”和“囊蚴外繁殖”。产生无性生殖的种原，可能来源于囊蚴内具有生物活性的游离颗粒。本次观察最早出现无性生殖麦穗鱼的感染日龄为98d。具体发育过程为：①囊蚴内繁殖：囊蚴内具有生物活性的游离颗粒，在一定的条件下，逐步分化发育呈2个及其以上的幼体成为胞囊蚴（图1-Ⅴ、Ⅵ），幼体在胞囊蚴内发育成熟后，从胞囊蚴中分离、移出成为新的囊蚴个体。②囊蚴外繁殖：囊蚴通过发育，外囊壁逐渐向左右扩张形成空腔，囊蚴体居中形成“正眼囊蚴”（图1-Ⅰ），空腔为生殖新生囊蚴准备了空间→发育到一定程度后，囊蚴体偏向一方，囊蚴内囊壁的某一方位变模糊，形成“偏眼囊蚴”（图1-Ⅱ），变模糊的地方组织松软，为释放具有生物活性的游离颗粒提供了方便→具有生物活性的游离颗粒从囊蚴内囊壁变模糊的地方释放出后，经过一定时间发育成为“黑点囊蚴”（图1-Ⅲ），黑点囊蚴的黑点，是新生囊蚴的排泄囊雏形→进一步发育成“双姊囊蚴”（图1-Ⅳ），“双姊囊蚴”发育成熟后一分为二，完成整个无性生殖过程。此次实验观察麦穗鱼无性生殖发生率为13.33%，说明不是每一尾麦穗鱼或每一个囊蚴都会发生无性生殖，这为发现麦穗鱼体内发生第二次无性生殖现象增加了难度。控制华支睾吸虫在第二中间宿主麦穗鱼体内，产生无性生殖的机理目前尚不清楚，还有待进一步研究。3.3实验观察影响因素分析此次实验观察的某些影响因素值得分析总结：①气温与季节选择。此次实验无性生殖发生率较低为13.33%，B组只有1尾麦穗鱼发生。这与此次实验季节有关，8、9月间广州正处于酷暑高温季节，气温在39℃左右；加之实验只是一次性投放较少尾蚴。如果是在气温25℃左右的春秋时节，麦穗鱼又长期处于疫水中，有更多的尾蚴重复感染，无性生殖的发生率应当会大大提高；②微小环境把握。此次实验观察，A组感染的微小环境与自然环境接近，水容量大，又有水生植物生长，感染的尾蚴数比B组少，而华支睾吸虫囊蚴感染率与感染度均比B组高，推荐采用A组实验方法效果更好；③实验用鱼大小要适度。此次实验是首次进行，麦穗鱼是选大的好，还是选小的好，无前人经验借鉴，如果实验用鱼过大，会增加检查工作量，选择当年生