鹅不食草治疗过敏性鼻炎的作用机理研究

鹅不食草治疗过敏性鼻炎的作用机理研究

过敏虱是临床上常见的疾病和疾病，发病率约为5%，严重危害人民生活和工作。病因主要与花粉、灰尘和细菌的转化有关。豚草花粉作为北美地区的主要过敏原,近20年来在我国许多地区已成为过敏性鼻炎的主要病因之一。近年来国内外不少学者对鹅不食草(又名通天窍)治疗过敏性鼻炎进行了许多研究,NaitoK等报道了鹅不食草在治疗过敏性鼻炎过程中有减轻鼻阻塞的作用。陈鹤凤、阎荣军等分别报道了鹅不食草软膏、浸液在治疗过敏性鼻炎中有较好的治疗疗效。但目前对鹅不食草治疗过敏性鼻炎的研究大部分仍局限在临床疗效的观察上,而通过建立过敏性鼻炎动物模型,进一步探讨鹅不食草作用机理以及观察治疗前后鼻黏膜组织超微结构的动态变化,尚未见报道。本研究选用豚草花粉建立过敏性鼻炎动物模型,以探讨鹅不食草治疗前后鼻黏膜组织形态学的变化,报道如下。1材料和方法1.1在清洁级动物饲养室饲养豚鼠30只,雌雄各半,体重(400±50)g,在清洁级动物饲养室饲养,由中山大学医学动物实验中心提供。豚鼠分为正常对照组、阳性对照组、鹅不食草治疗组(鹅不食草挥发油滴鼻)3组,每组10只。1.2声粉碎仪、荧光分光光度计、透射电子显微镜0.5%地塞米松麻黄素(江西医学院第一附属医院院内制剂),超声粉碎仪(150uSE,日本),高速冷冻离心机(JZ-21BACKMAN,德国),荧光分光光度计(F-3010,HITACHI,日本),透射电子显微镜(TEM-100CX,日本)。1.3虎林市不食草挥发油乳状液的制备鹅不食草(CentipedaminimaL.)于夏季采收,经江西医学院药理教研室形态鉴定后,洗净、晒干,然后经过蒸馏、石油醚萃取得鹅不食草纯挥发油,配制成0.5%鹅不食草挥发油乳状液。1.4山羊花粉转化前溶液的制备1.4.1收集猪草和花粉10月初于南昌市郊收集新鲜豚草(三叶裂豚草)花粉。1.4.2变应原的制备豚草花粉10g,过80目筛,与pH7.4的PBS缓冲液按1∶25稀释,在冰浴条件下匀浆和超声粉碎。然后经高速冷冻离心机离心30min(15000r·min-1),弃上层脂质,即为豚草花粉变应原。用紫外吸收法(Lowry法)测定蛋白质含量并稀释至8mg·mL-1,-20℃低温冰箱中保存备用。1.5过敏虱动物模型的建立1.5.1人工免疫接种阳性对照组及鹅不食草治疗组每只豚鼠用豚草花粉变应原液0.75mL与等量佛氏完全佐剂(FCA)或不完全佐剂(FIA)进行人工免疫接种。第1次采用变应原加佛氏完全佐剂,于腹腔注射0.5mL,四肢皮下(腋下、腹股沟)各注射0.25mL共1.5mL。2周后改为豚草花粉变应原加佛氏不完全佐剂,每周1次,连续2周;正常对照组以生理盐水代替抗原,注射方法同致敏组。1.5.2外加样器加样回收于第4周末进行鼻腔激发,模型组配制0.5%的豚草花粉变应原生理盐水溶液,用加样器滴入豚鼠双侧鼻孔(每侧10μL),每日1次,连续5d后改为隔日激发1次(维持)。正常对照组以生理盐水代替抗原滴鼻。实验组小鼠出现明显打喷嚏、流清涕、抓挠鼻、面部等症状,而正常对照组无明显症状和体征。1.6改网激发降低正常对照组在治疗阶段用生理盐水滴鼻,每天3次,共15d。阳性对照组:在激发第5天后改为隔日抗原滴鼻激发1次(模型维持),同时用生理盐水滴鼻治疗,每天3次,共15d。药物治疗组:在激发第5天后改为隔日抗原滴鼻激发1次,同时用0.5%鹅不食草挥发油滴鼻治疗,每天3次,共15d。1.7鼻黏膜组织病理学观察鼻黏膜组织病理动态变化的光镜、电镜观察:将豚鼠于末次局部激发后1.5h在40mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉下分别断头处死迅速打开鼻背,取双侧鼻甲及鼻中隔黏膜,部分鼻黏膜组织放入10%甲醛溶液中固定,石腊切片、HE染色、光镜下观察。部分鼻黏膜组织迅速放入2.5%戊二醛溶液中,磷酸缓冲液浸洗后用1%锇酸固定、系列酒精脱水、Epon812包埋,半薄切片、甲苯二蓝染色、光镜下定位,超薄切片机超薄切片,醋酸铀枸缘酸铅染色、TEM-100CX透射电镜观察。2结果2.1含“桥粒”的细胞器鼻黏膜上皮组织结构清晰,可见黏膜上皮层和固有层(图1-A),上皮细胞核规则,位于细胞的基底部,呈卵圆形。细胞游离缘有许多粗短的微绒毛(图1-B),细胞内可见丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基体等细胞器(图1-C)。线粒体体嵴长而密,彼此呈平行排列,且与线粒体长轴垂直,腔内基质电子密度中等,粗面内质网发达,呈板层状排列,细胞与细胞之间以“桥粒”相连。上皮细胞下为基底膜及固有层,固有层见成纤维细胞及大量的胶原纤维,胶原纤维呈束状,无炎性细胞浸润。2.2细胞不健全、组织病理学鼻黏膜上皮组织充血水肿,炎性细胞明显浸润(图1-D),鼻黏膜上皮细胞结构明显改变,细胞核变形,不规则,微绒毛减少或消失(图1-E)。细胞内可见大量溶酶体出现,线粒体肿胀、体嵴消失、细胞器空泡化,细胞间连接不清晰。固有层结缔组织细胞结构紊乱,细胞器破坏,成碎片状,胶原纤维不清晰,排列紊乱(图1-F)。固有层嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润。2.3基底膜的结构鼻黏膜上皮组织结构清晰,组织仍有充血水肿,但较阳性对照组明显减轻(图1-G),上皮细胞核规则,呈类卵圆形,微绒毛较阴性对照组无明显变化(图1-H)。细胞内线粒体不肿胀,但体嵴减少、变短,细胞与细胞之间以“桥粒”相连(图1-I)。同时可见含大量分泌性颗粒的杯状细胞,基底膜结构未见明显改变。固有层见成纤维细胞及大量的胶原纤维,胶原纤维呈束状分布,可见淋巴细胞浸润。3鼻黏膜组织病理学改变鹅不食草,别名地胡菽、又名通天窍,其味辛、性温,有祛风、散寒、通窍之功。近年来国内外不少学者运用鹅不食草治疗过敏性鼻炎取得了良好疗效,并积累了丰富的经验。余洪猛等报道鹅不食草挥发油组在治疗过程中症状逐渐得到控制,嗜酸性粒细胞在外周血、鼻分泌物、鼻黏膜组织中明显减少,黏膜组胺含量也明显少于阳性对照组。本实验形态学观察可见阳性对照组鼻黏膜上皮细胞出现明显的病理变化。细胞核变形、细胞器空泡化、线粒体肿胀、体嵴消失、溶酶体大量出现,固有层结缔组织细胞结构紊乱,大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞浸润,这与YenCH等报道的结果一致。阳性对照组淋巴细胞大量浸润,与Th2辅助细胞在过敏性鼻炎的迟发反应期调节嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞的募集和其他效应细胞的活性起重要作用。鹅不食草挥发油治疗组鼻黏膜上皮细胞结构清晰、细胞器未见破坏,固有层胶原纤维呈束状、可见淋巴细胞浸润,未见嗜酸性粒细胞和肥大细胞。提示鹅不食草挥发油可能有调节细胞免疫、抑制Th2细胞及细胞因子的产生、阻止以TH2-IgE-肥大细胞(嗜碱性粒细胞)-嗜酸性粒细胞为轴心的免疫反应,从而减轻鼻黏膜