第一章绪论1基因工程

课程名称：基因工程原理课程类别：校级选修课授课学时：27考试方式：开卷授课教师：刘建华联系方式一章绪论

基因工程的概念基因工程的诞生与发展基因工程研究的主要内容基因工程的意义与发展前景

第一节基因工程的概念

基因工程是在分子水平进行的遗传操作,指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,转移到另一种生物体(受体)的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。一、概念基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。由于被转移的基因一般需与载体DNA重组后才能实现转移因此：供体、受体和载体被称为基因工程的三大要素。二、基因工程(geneengineering)常和以下名称混用重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)遗传工程(geneticengineering);基因操作(genemanipulation);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);重组DNA技术重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操程序，也称为分子克隆技术。遗传工程广义：包括细胞工程和基因工程。狭义：就是基因工程。一般所说的遗传工程就是基因工程克隆作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。

作动词时是指基因的分离与重组过程。三、基因工程的用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种9

第二节基因工程的诞生与发展一、基因工程诞生的理论基础（一）理论上的三大发现1.证实了DNA是遗传物质。2.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理。3.遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。10S型R型特征光滑菌落（smooth）粗糙菌落（rough）有多糖荚膜无荚膜具有毒性无毒性抗原型SⅠ、SⅡ、SⅢRⅠ、RⅡ表1肺炎双球菌的类型及特征FredericGriffith1879—1941图Griffth的肺炎双球菌转化实验S型死菌R型活菌R型S型S型死菌△S+R转化物质R型菌体S型菌体S型死菌遗传物质Griffth对实验结果的推测S菌株多糖脂类蛋白质RNADNAR菌落DNA+DNaseR菌株R菌株R菌株R菌株R菌株R菌株分离纯化杀死灭活R菌落R菌落R菌落R菌落R+S活的活的活的活的活的死的（二）技术上的三大发明1.限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3.基因工程载体的研究与应用一、基因工程诞生的理论基础限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割1970年,Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindⅡ,使DNA分子的切割成为可能.1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoRⅠ的核酸内切酶.后来陆续发现了大量类似于EcoRⅠ核酸内切酶，每种有各自独特的识别序列.这为基因工程提供了重要的技术基础∴DNA分子核酸内切酶一系列不连续的片段DNA连接酶的发现与DNA片段的连接1967年,世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。1970年,美国的威斯康星大学(WisconsinUniversity)的Khorana实验室又发现了T4噬菌体DNA连接酶,具有更高的连接活性。1972年底,人们已经掌握了好几种连接双链DNA的方法,使基因工程的创立又迈进了重要的一步。13基因工程载体的研究与应用从1946年起，Lederberg开始研究细菌的性因子——F因子。到20世纪60年代，相继发现其他质粒，如抗药性因子（R因子）和大肠杆菌素因子（CoE）。1973年，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用。这是基因工程诞生第三项技术发明。二、基因工程的诞生（一）基因工程诞生的背景20世纪70年代初期,有关基因工程的理论获得重大突破.基因工程的一些相关技术得到发展，并很快应用于基因操作实验。如：①外源DNA对感受态大肠杆菌细胞的转化技术

②琼脂糖凝胶电泳技术

③Southern转移杂交技术等

∴无论在理论上还是技术上，都已经具备开展DNA重组的工作条件。（二）基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组，并因此与W.Gilbert及F.Sanger分享了1980年度的

诺贝尔化学奖。具体实验过程酶切酶切T4噬菌体连接酶杂种DNA分子(SV40和λDNA重组)

猿猴病毒SV40λ噬菌体DNA第一个重组体构建181973年,美国斯坦福大学的S.Cohen等人也成功地进行了另一个体外DNA重组实验.具体实验过程R6-5质粒DNApSC101质粒DNAEcoRⅠ切割T4连接酶重组DNA分子转化E.coli转化子菌落表现出双重抗性特征注:①R6-5:编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌素质粒DNA。②Psc101：编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌素质粒DNA。

随后S.Cohen又与H.Boyer等人合作进行了一系列实验。具体实验过程非洲爪蟾的编码核糖体基因的DNA片段Psc101质粒重组导入E.coli非洲爪蟾的基因进入了E.coli细胞，并转录出相应的mRNA产物基因工程发展史上第一次实现转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年（1973年）被定位基因工程诞生的元年。三、基因工程的发展基因工程的艰难阶段基因工程的逐渐成熟阶段基因工程的迅速发展阶段

1971年史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶

酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。

1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和

噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来

得到新的DNA分子。

1973年科恩（CohenS.）等进一步将酶切DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli

细胞中。典型事件：22

1982年美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。

1983年转基因烟草和马铃薯获得成功。

1994年延熟保鲜的转基因番茄商品生产。

1997年克隆羊“多莉”诞生（苏格兰科学家利用6岁成年母羊乳腺细胞）。1998年美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。2000年美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。2001年美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2003年5月意大利宣布克隆成功克隆马“普罗梅泰亚”（世界上首次由哺乳动物生下它自己的克隆体，既是母女、又是姐妹关系）。2003年

12月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。

2005年12月韩国克隆狗斯努皮Snuppy（中）。

第三节基因工程研究的主要内容一、基因工程的主要内容基础研究克隆载体的研究受体系统的研究目的基因的研究生物基因组学研究应用研究等（一）基础研究自基因工程问世以来，基因工程的基础研究一直受到科技工作者的重视，主要包括：

构建一系列克隆载体和相应的表达系统建立不同物种的基因组文库和cDNA文库开发新的工具酶探索新的基因工程新技术、新操作方法27（二）克隆载体的研究1.研究克隆载体的意义由于基因工程的发展与克隆载体的构建密切相关，因此，构建克隆载体是基因工程技术的中心环节。（二）克隆载体的研究2.研究成果最早构建和发展的是用于原核生物的克隆载体，促进了以原核生物为对象的基因工程研究的迅速发展.Ti质粒的发现及Ti质粒衍生的克隆载体的成功构建，使植物基因工程研究得到迅速发展。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究取得进展。29（二）克隆载体的研究3.今后的研究重点构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一，尤其是构建适合于高等动物和高等植物转基因表达载体和定位整合载体。（三）受体系统的研究1.何谓受体受体是克隆载体的宿主,是外源目的基因表达的场所。2.用于基因工程的受体的分类原核生物真核生物受体31原核生物原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，几乎是现有一切克隆载体的宿主。建立了一系列基因组文库和cDNA文库，以及大量转基因工程菌，开发了一批已投入市场的基因工程产品。大肠杆菌作为受体32真核生物

酵母菌是较早被用于基因工程受体的真核生物（酵母菌是十分简单的单细胞真核生物，基因组相对较小，有的菌株还含有质粒，便于基因操作）。酵母菌作为受体建立了一系列工程菌株，不仅是外源基因（尤其是真核基因）表达的受体，而且是当前建立人和高等动物及高等植物复杂基因组文库的受体系统33真核生物随着克隆载体的发展，高等动植物也用作基因工程的受体：高等植物

用于基因工程受体的一般是高等植物的愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。

目前用于基因工程受体的双子叶植物有拟南芥、

烟草、番茄、棉花等；单子叶植物有水稻、玉米、

小麦等，并且也获得了相应的转基因植物。

真核生物高等动物

动物由于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞和胚细胞作为基因工程受体，并获得了转基因鼠、鸡、鱼等动物。

动物体细胞用于基因工程受体主要是为获得系列转基因细胞系，或用于基础研究材料，生产基因工程药物。人的体细胞同样可作为基因工程杂受体，获得的转基因细胞系可用于病理研究和基因治疗。（四）目的基因研究1.什么样的基因可以称为目的基因总的来说，基因工程研究的基本任务是开发人们特殊需要的基因产物，则相应的基因就称为目的基因。具体来说，具有以下特征的可被称为目的基因：

具有优良性状的基因致病基因目前还不清楚其功能的基因36（四）目的基因研究2.获得目的基因的途径

构建基因组文库和cDNA文库，从而筛选出目的基因。