植物生理学实验报告植物NR活力测定

实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型:探索、综合或验证实验项目名称：植物NR活力测定 体内法（活体法）一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。二、实验内容和原理实验原理：硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，与作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根：NO-+NADH++H+nr.NO-+NAD++HO3 二、实验内容和原理实验原理：硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，与作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根：NO-+NADH++H+nr.NO-+NAD++HO3 2 2NO,Ji植物细胞 、NADFV―__"炖 no3外界溶液NO.测定原理：根产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加。磺胺先与亚硝酸钠形成重氮盐，再与a-奈氨偶联形成紫色物质。反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。三、主要仪器设备1.N。次横胺+O-兼基乙烯二胺*1.!红色化合物后加!540mn最大吸收峰测定。D2.3.材料：在20°C蒸馏水培养一周小麦苗组加KNO3，一组加0.5mMCaCl2，在白天置光照下处理。试剂：磺胺试剂、萘基乙烯二胺溶液，酶促反应液（PBs+KNO）器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱实验前一天分两组，一四、操作方法与实验步骤事先制作好NO-标准曲线。2在20°C蒸馏水培养一周小麦苗，实验前一天分两组，一组加KNO3,一组加0.5mMCaCl2，在白天置光照下处理。 '取各组苗地上部约0.5g左右,切成合适长度（1cm左右），放入50mL注射器中。加酶促反应液10ml，抽气直到材料完全下沉（一只手戴上手套，用戴手套的食指封住注射器头，另一只手反复推拉抽气减压，将叶片中的空气赶尽，直到材料完全下沉）。置恒温箱30C20min，取出后将反应液注射入烧杯中。取4ml反应过的液体，加磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml,室温放置5min后测540nmOD。五、实验数据记录和处理NO-标准曲线2442y=A0062x4-0.442y=A0062x4-0.0283R3=0.99620 3。 60SO130150NQf含量CniiDl)o.o.o.o.1802.取苗上部重量OD540值对照组0.52g0.115处理组六、实 —0.51g0.280验结果与分析NO-标准曲线为：y=0.0062x+0.0283(R2=0.9962)2对照组NO2-(nmol)=(0.115-0.0283)/0.0062=13.98处理组NO：-(nmol)=(0.280-0.0283)/0.0062=40.60NR活力(No-生成nmol/(鲜重g.h))2=NO2-(nmol)X3X(10/4)/实际重量g对照组NR活力=13.98*3*2.5/0.52=201.63nmol/g.h)处理组NR活力二40.60*3*2.5/0.51二597.06nmol/g.h)七、讨论、心得1.比较KNO3诱导和加NH4Cl的NR活力大小，诱导时如用NaNO,替

代KNO结果会如何，为什么？ 3如不进3行光照，结果会怎么样，为什么？A.如用NaNO替代KNO，那么光合呼吸作用减弱，酶的活力降低，从而影响硝酸根3转化为亚硝酸根，实验中可能两组紫红取材质量OD540值处理后液体颜色NO-(nmol)NR活力(nmol/g.h)CK0.52g0.115有轻微紫色13.98201.63处理组0.51g0.280颜色较紫40.60597.06色的颜色差别很小，使测得的还原酶活力偏低。原因：K+离子可以调节渗透，气孔开闭，促进氧化磷酸化，另外钾火花呼吸作用和光合作用的酶的活性，是40多种酶的辅助因子，是形成细胞膨胀和维持细胞内电中性的主要阳离子。而Na+离子虽然可以部分地代替钾的作用，但不能完全替代。B.如不进行光照，结果可能是两则的实验结果相差不大，而且所测定的还原酶的活力都很低。原因：之前的呼吸作用已经消耗大量的糖类，而在没有光合作用的条件下，苗储存的糖类很少，所以呼吸作用会大大减弱，使酶活力比预期结果低，两组亚硝酸盐含量相差不多。亚硝酸是过多施用氮肥后蔬菜中积累的致癌物质，请根据本实验写出简易测定蔬菜亚硝酸含量的方法。取待测蔬菜的组织，用酶促反应液浸提，取适量的反应液加磺胺和萘基乙烯二胺溶液，静置后观察颜色深浅。若颜色越深，则代表蔬菜中亚硝酸含量较多；反之，则较少。

光谱法和色谱法精度高，但是对仪器或者实验条件要求较高，不符合简易测定的要求1。Table2不同光谱法测定硝酸盐和亚硝酸盐的比较方法名祢 优点 缺点些密外希*府洋噪僧简单'准确度高，重现4紫外分光光度法 定性、定置和痢伽格里斯分光光度法简便'快速’鹫爵’窿1为L苯酚分光光度法 快速、简单、准确系例馨囊长分 准确，精密度高几1兀俄，有网F引 仪器简单,操作简便,易于:/沼L 分析，分析速度快，帝密j寸乳兀*成 试剂、试样用登少，适用'性好，能准珈度不高，有的1低 有限制性，不可,单性好r精磷度有限，椎测性;耗时,易受其他杂另准确度有限，易受剥操作繁琐庄续自动灵蚊度有限，检浏极眼;变高，定性有限*限于分析电隹较广 化学成分阶段U有限，i干扰旋干扰有限.稳1简单的Table1不同色谱法测定硝酸盐和亚硝酸盐的比较方法名称优点缺点HPLC快速、准胡、灵敏度高、靖密度高所用试剂有毒，对实验人员

与环境有危害，费用高仪器昂贵仪器昂贵简便、选择性好、灵敏度高'准醐

度高、分析速度快，•欲丑样能同

时测定多种I畀高子GC操作简便，抗干也能力强'

线性范围宽.检出限值具有局限性，仪器昂贵,

需要专业技术人员现场快速检测法：方法能够应用于现场，并在30min内出具检测结果。主要是根据亚硝酸盐与显色剂的显色反应来测定亚硝酸盐的含量，一般采用试纸、试剂盒等形式。李健2等根据显色剂显色反应测吸光度的原理研制出一种可以快速、简便、灵敏、安全的针对亚硝酸盐国际限量(4mg/kg)的试剂盒，用于检测蔬菜中亚硝酸盐的含量，可以满足现场快速检测的需要。亚硝酸根试纸、试剂盒具有体积小、便于携带、检测方便、成本低廉等特点，具有