灯盏花素对糖尿病大鼠肾组织巨噬细胞浸润的影响

灯盏花素对糖尿病大鼠肾组织巨噬细胞浸润的影响

近年来的研究表明，诱导肾组织炎的肾组织炎过程是糖尿病肾炎（dn）第一次损伤可持续发展的重要因素之一。晚近有学者发现免疫抑制剂霉酚酸酯(Mycophenolatemofetil,MMF)对DN的保护作用机制主要是抑制肾组织巨噬细胞浸润。灯盏花素(Breviscapine)是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬全草灯盏细辛中提取出的一类黄酮类成分,其药理作用有较强抗氧化、抑制蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)活性作用。最近,我们与其他学者在大鼠DN模型中已初步证实其能降低蛋白尿、改善肾小球结构异常。由于糖尿病状态下氧化应激增加产生的氧反应产物(Reactiveoxygenspecies,ROS)及PKC激活均可诱导多种炎症介质产生刺激肾组织巨噬细胞浸润,灯盏花素是否能抑制糖尿病肾组织巨噬细胞浸润尚未见文献报道,本研究从DN炎症发病角度进一步探讨其肾脏保护机制。1材料和方法1.1单抗ss-nd-pcrmsf灯盏花素:云南玉溪药业有限公司产品,临用前用5g·L-1羧甲基纤维素钠配制所需浓度的混悬液;MMF:瑞士罗氏制药有限公司产品,临用前溶解在5%二甲基亚砜中,并用花生油稀释至所需浓度;链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):Sigma公司,临用前溶解在0.01mol枸橼酸缓冲液中,pH4.5;尿白蛋白测定试剂盒:法国SPI公司产品;PKC活性测定试剂盒:Calbiochem公司;兔抗大鼠单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)多克隆抗体及小鼠抗大鼠ED-1(巨噬细胞表面标志)单克隆抗体:SantaCruza公司产品;生物素标记的羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG:武汉博士德公司产品;链酶亲和素-生物素复合物(SABC):武汉博士德公司;内源性生物素封闭剂:福建迈新生物技术开发有限公司;DAB试剂盒:北京中山技术有限公司。1.2分组及给药方法40只昆明种SD大鼠,♂,体重180～200g,安徽医科大学动物中心提供。所有大鼠均行右侧肾切除术,2wk后按体重分层随机分对照组、模型组、灯盏花素给药组及MMF给药组,每组10只。糖尿病模型建立采用腹腔一次性注射STZ60mg·kg-1方法,灯盏花素20mg·kg-1·d-1,灌胃给药,MMF10mg·kg-1·d-1,灌胃给药,对照组、模型组给予等量溶媒。灯盏花素与MMF均为通过预试验所选合适剂量。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食,自由饮水,不应用胰岛素,整个实验观察8wk。1.3肾组织病理学检测大鼠处死前2d进代谢笼,准确收集24h尿液,离心分装后保存于-70℃冰箱中待测尿白蛋白含量。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本,4℃离心取血浆保存于-20℃待测血糖水平。肾脏通过右侧颈总动脉插管注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗,至整个肾脏颜色变苍白后游离,置于冰上,取8mm3大小肾组织置于10%中性甲醛溶液中固定,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,制成厚度为3μm切片,行PAS染色。同时制4μm多聚赖氨酸处理切片,免疫组化研究。剩余肾组织分别切成小块,置于液氮中,冻透后转入-70℃冰箱中待测肾组织PKC活性。1.4双管测定尿白蛋白测定采用EIA,严格按照试剂盒说明书操作。标准液浓度1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81μg·L-1,设双管测定。24h尿白蛋白排泄率(Albuminexcretionrate,AER))为尿白蛋白含量与24h尿量乘积。1.5放射性活性测定肾组织细胞膜和细胞浆分离采用超速离心法,蛋白定量采用考马斯亮蓝法,PKC活性采用放射活性测定法,严格按照试剂盒说明书操作。酶的活性单位表示为nmol·g-1·min-1,胞浆PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所测的实际活性与对照组所得的活性之差表示,细胞PKC总活性(PKCt)为胞浆及胞膜PKC活性之和。1.6小鼠ed-1免疫法检测小鼠血清蛋白及表达采用SABC法:切片常规脱蜡水化,3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶;用微波暴露抗原,封闭内源性生物素和亲和素;滴加1∶10正常羊血清或兔血清;10%小牛血清蛋白室温下孵育2h,封闭非特异性抗原。分别滴加兔抗大鼠MCP-1与ICAM-1多克隆抗体(均为1∶200)及小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体(1∶50),4℃过夜。滴加生物素化二抗IgG(1∶200),37℃40min;滴加SABC,37℃20min。洗涤后室温下滴加DAB显色液,镜下控制显色时间。中止反应后,苏木素复染3min,1%盐酸乙醇分化。常规脱水、透明、封片。实验均采用删除第一抗体作阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状,在高倍镜视野下随机选择50个肾小球,计数每个肾小球横截面积(glomerularcrosssection,gcs)ED1阳性细胞数,取均值;MCP-1、ICAM-1免疫组化阳性结果判断应用图像分析系统,计算其阳性指数(Positiveindex,PI),PI=[阳性信号面积×平均阳性强度(平均灰度值)/肾小球面积。1.7统计分析方法实验数据以x¯±sx¯±s表示,应用SPSS11.0软件包进行统计分析,参数资料采用One-WayANOVA检验,非参数用秩和检验。2结果2.1mf对mf的影响模型组血糖明显高于、体重明显低于对照组(P<0.01),灯盏花素或MMF给药组血糖、体重与模型组相比无差异;模型组肾重、肾重/体重及AER明显高于对照组(P<0.05,P<0.01),灯盏花素或MMF给药组肾重、肾重/体重及AER明显低于模型组(P<0.05,Tab1)。2.2肾组织相关活性模型组肾组织PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明显高于对照组(P<0.05,P<0.01);灯盏花素给药组肾组织PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明显低于模型组(P<0.05);MMF给药组肾组织PKC活性与模型组相比无差异(Tab2)。2.3小鼠脏器+模型的小鼠骨髓水浸单次给药的效果对照组肾小球有少许巨噬细胞浸润,模型组肾小球巨噬细胞浸润明显高于对照组(P<0.01),灯盏花素或MMF给药组肾小球巨噬细胞浸润明显低于模型组(P<0.05);对照组肾小球MCP-1、ICAM-1表达较弱,模型组表达明显高于对照组(P<0.01),灯盏花素或MMF给药组肾小球MCP-1、ICAM-1表达明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),但灯盏花素给药组肾小球ICAM-1表达高于MMF给药组(P<0.05,Tab3,Fig1)。3对糖尿病肾组织细胞黏附因子的影响实验研究表明糖尿病模型建立后24h肾小球内即出现大量巨噬细胞浸润,随着时间延长逐渐增多,并与IV型胶原表达、肾小球结构改变相一致,在临床DN患者肾组织标本中也发现类似情况。浸润的巨噬细胞通过释放前炎症介质、前硬化介质及ROS导致肾组织损害。目前DN的治疗仍以控制高血糖、阻断肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensinsystem,RAS)为主,但大部分患者仍然缓慢进展至终末期肾衰。晚近Sassy-Prigent等报道在糖尿病早期应用胰岛素严格控制血糖可完全抑制肾内巨噬细胞浸润及MCP-1mRNA表达,阻断RAS则可部分抑制肾内巨噬细胞浸润及MCP-1mRNA表达,对肾组织ICAM-1、血管细胞黏附因子及肿瘤坏死因子α、白介素-1β表达无明显影响。如在改善糖尿病糖代谢与血管动力学紊乱基础上,选择特异性抑制肾组织炎症过程的药物可能会进一步改善DN预后。MMF可非竞争性、可逆性地抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶,阻断鸟嘌呤核苷酸的从头合成途径,使鸟嘌呤核苷酸耗竭,进而阻断DNA和RNA的合成,其主要药理作用抑制淋巴细胞与单核细胞增殖,减少抗体产生,抑制细胞表面粘附分子的合成,对系膜细胞及平滑肌细胞有抑制作用。晚近,Utimura等与我们在STZ诱导的单侧肾切除糖尿病模型中发现MMF可明显减轻蛋白尿、抑制肾小球肥大及硬化,其机制主要为抑制肾小球内巨噬细胞浸润,对糖尿病肾小球血流动力学紊乱无明显影响。由于MMF应用于DN临床安全性尚待进一步证实,该实验以MMF为阳性对照,选择具有明显肾脏保护作用的中草药灯盏花素,观察其对糖尿病肾组织巨噬细胞浸润的影响,研究结果显示灯盏花素同MMF一样可抑制糖尿病肾组织巨噬细胞浸润,进一步从抗炎角度证实其肾脏保护作用。糖尿病肾组织巨噬细胞浸润与激活主要由MCP-1与ICAM-1介导,其中MCP-1是巨噬细胞特异性趋化因子,对巨噬细胞有较强的趋化与激活作用,ICAM-1主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附作用。最近,我们研究表明MMF对糖尿病肾组织巨噬细胞浸润的抑制主要是通过下调MCP-1与ICAM-1表达实现。糖尿病状态下肾组织MCP-1与ICAM-1表达增加既有代谢紊乱因素,又有血流动力学因素,代谢紊乱与血流动力学因素也是肾内氧化应激增加与PKC激活的起始因素,ROS可直接诱导MCP-1与ICAM-1表达,在体外高糖培养的肾小球系膜细胞已证实ICAM-1表