犬肾缺血再灌注损伤的治疗与机制研究

犬肾缺血再灌注损伤的治疗与机制研究

再次注入肾的手术过程（i.r）是不可避免的。缺血预处理(IPC)是指在预计缺血发生前对器官进行1次或多次短暂的缺血再灌注,而缺血后处理(IPO)是指在缺血发生后、长时间的再灌注之前对脏器进行数次短暂的再灌注缺血的处理方法。我们先前的研究已经证实,IPO能有效减轻大鼠的肾I/R。2009年3～9月,我们对IPC与IPO对犬肾I/R的作用进行了同步观察,并探讨其可能机制。1材料和方法1.1各组患者的手术情况健康成年雄性杂种犬24只,体质量13～20kg,随机分为4组,各6只:假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血预处理组(IPC组)、缺血后处理组(IPO组)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒,TUNEL细胞凋亡试剂盒。1.2左肾动、静脉夹闭前后的再灌实验犬开腹,游离双肾。S组:切除右肾,缝合腹壁;I/R组:切除右肾、游离左肾后,左肾动、静脉夹闭60min后恢复灌流;IPC组:在左肾动、静脉夹闭前现予5min的缺血、5min的再灌,共3次,然后恢复灌流;IPO组:在肾动、静脉夹闭60min后立即再灌注30s、再缺血30s,共6次,然后恢复灌流。1.3静脉血2ml分别于术前和再灌注后24、48、72d采静脉血2ml。再灌注后72d取犬左肾组织,一部分速置-80℃冰箱保存待测,另一部分4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、制备切片。1.4尿素氮bun静脉血离心分离血清,全自动生化分析仪测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。取肾组织制成10%的匀浆,硫代巴比妥酸法测定肾组织丙二醛(MDA),黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,化学比色法测定髓过氧化物酶(MPO)。1.5肾组织中凋亡细胞的检测4%多聚甲醛固定后的肾组织切片HE染色后在200倍光镜下观察。采用TUNEL法检测肾组织中的凋亡细胞,随机选取5个视野,400倍光镜下计数凋亡细胞,以凋亡细胞数占肾小管上皮细胞总数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)。1.6统计方法采用SPSS11.5统计软件。组间比较用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1给药24、48和72小时后，将血清bun和cri值进行比较2.2然后在72小时后比较各组肾脏组织的sod活性、mda和pmo2.3管腔扩张的管型光镜下S组肾小球、肾小管结构正常;I/R组肾间质水肿,大量炎性细胞浸润,大量肾小管上皮细胞坏死、脱落,管腔扩张,其中可见大量管型;IPC组及IPO组可见肾间质轻度水肿,肾小管上皮细胞扁平,偶见管型。S组AI为2.7%±1.3%、I/R组为28.4%±6.2%、IPC组为17.1%±3.8%、IPO组为15.4%±4.1%。I/R、IPC、IPO组与S组相比,P均<0.01;IPC、IPO组与I/R组相比,P均<0.05。3功能损害:及其功能IPC对许多器官及组织有预防损伤的作用。但IPC对肾脏损伤的作用,相关研究都集中于小动物,且一直存在争议。研究发现,IPO可以明显改善大鼠肾的I/R。本研究中,我们建立犬肾I/R模型,选择缺血时间为60min。肾功能检测结果表明模型建立成功。在IPC中我们选择3个循环的5min灌注、5min缺血的处理方式,再灌注24、48、72h后犬的肾功能明显改善。在IPO中我们选择了6个循环的30s灌注、30s缺血的处理方式,也明显改善了犬的肾功能。氧自由基是肾I/R的重要介质。大量的氧自由基会使DNA变性、蛋白质氧化、脂质过氧化,严重者导致细胞死亡。同时,大量氧自由基可致SOD含量降低,加重血管内皮细胞损伤。SOD活性可反映机体清除氧自由基的能力,MDA含量可反映脂质过氧化的程度。本研究发现,IPC、IPO均使肾组织SOD活性升高、MDA含量降低,即提高了肾组织抗氧化的能力,减轻了其脂质过氧化的程度。近年来研究发现,白细胞的浸润也在肾I/R中起着重要作用。MPO是中性粒细胞聚集的特征酶,可反应中性粒细胞聚集的程度。本研究发现,犬肾血流阻断及恢复灌注后,肾组织中的MPO活性均比S组增高,IPO组的MPO活性较I/R组明显降低。证明肾组织中的白细胞滞留、聚积增多参与了肾脏损伤的病理生理过程。本研究结果还显示,I/R组的肾组织中上皮细胞凋亡明显增加,而IPC、IPO组肾组织中上皮细胞凋亡与I/R组相比减少明显。提示IPC、IPO对犬肾发挥的抗损伤作用可能与抑制细胞凋