葛根素对早期糖尿病肾病大鼠肾组织bmp-7及mrna表达的影响

葛根素对早期糖尿病肾病大鼠肾组织bmp-7及mrna表达的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病最常见的微血管并发症。渐进性肾损害是糖尿病和糖尿病患者最终死亡的主要原因。骨形态发生蛋白-7(Bonemorphogeneticprotein-7,BMP-7)是转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族成员之一,不仅在肾脏发育形成、维持正常功能中具有重要作用,还能够明显改善肾纤维化进程。在1型糖尿病大鼠DN形成早期和进展中,大鼠肾脏BMP-7及其受体表达减少或丧失。近年来研究发现,体外BMP-7能通过抑制肾小管上皮细胞转分化(Tubularepithelialtomenchymaltransdifferentiation,EMT)过程,抑制肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏素、纤维连接蛋白和结缔组织生长因子(Connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的表达,并逆转TGF-β1诱导的EMT,使肾小管的动态平衡恢复和肾功能改善,从而可以防治DN肾小球和肾间质纤维化,亦可能通过人白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1等介质的表达来发挥作用。近年来实验研究证实,葛根素(Puerarin,Pue)可显著改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗,降低糖尿病大鼠血糖,对DN大鼠肾病变有保护作用。本研究在Pue降血糖的基础上,进一步研究其对链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的早期DN模型大鼠生化指标、肾组织病理形态学、超微结构的改变与BMP-7蛋白、mRNA表达的影响,探讨其对DN肾组织损害的保护作用及可能机制。1材料表面1.1光学显微镜和pcr扩增检测7600型全自动生化分析仪(日本日立公司);LKB-NOVA型超薄切片机(瑞典LKB公司);BX51F32H01型光学显微镜(日本Oympus公司);JEM-1230型电子透射式显微镜(日本电子公司);PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司);DYY-8C型中压电泳仪(北京市六一仪器厂);DK-8D型电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂);TanonGIS-2016凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司)。1.2试剂与试剂盒Pue(扬子江药业集团有限公司,批号:20081106,纯度:100.5%);依那普利(济南利民制药有限公司,批号:1001121,规格:10mg);STZ(美国Sigma公司,批号:S-0130);羧甲基纤维素钠(CMC-Na,湖南尔康制药有限公司,批号:20090701);枸橼酸、枸橼酸钠(台山市新宁制药有限公司,批号分别为20080601、20091203);葡萄糖、尿素氮测定试剂盒(日本和光纯药工业株式会社,批号分别为EH578、EG963);肌酐、尿蛋白液体试剂盒[德赛诊断系统(上海)有限公司,批号分别为60971014/1、60065769];尿微量白蛋白液体试剂盒(潍坊三维生物工程集团有限公司,批号:110201);胰岛素放射免疫分析药盒(天津市协和医药科技有限公司,批号:201011);兔抗大鼠BMP-7多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司,批号:bs-2242R);通用型SP免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:HK3400805);Trizol(美国Invitrogen公司,批号:51512101);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(美国MBIFermentas公司,批号:00066575);引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。1.3动物健康SD大鼠,♂,体质量200~250g,由安徽医科大学实验动物中心提供[动物使用合格证号:SCXK(皖)2005-001]。2方法2.1空腹血糖检测大鼠适应性饲养1周后,参照文献,禁食不禁水12h,一次性ipSTZ(溶于0.1mol/L枸橼酸缓冲液中)50mg/kg,72h后尾端采血,测定空腹血糖(Fastingbloodglucose,FBG),选择血糖值为13.8~30mmol/L者进行实验。挑选合格大鼠70只,均分为5组,即模型(0.5%CMC-Na)、依那普利(1mg/kg)与Pue高、中、低剂量(200、100、50mg/kg)组。另设正常对照(0.5%CMC-Na)组。ig给药,每天1次,连续5周。2.2肾组织中戊二醛检测给药前2天,将大鼠置于代谢笼中,收集24h尿液,3000r/min离心15min,取上清。末次给药后,大鼠禁食不禁水12h,水合氯醛麻醉,打开腹腔,腹主动脉取血,3000r/min离心30min,取上清。切取左侧肾脏,去除包膜,称质量。每组取3~4只大鼠,切取肾皮质,2.5%戊二醛预固定待作电镜观察,余肾经10%中性甲醛固定待作病理形态学观察和免疫组化检测。切取右肾称质量后立即于-80℃冷藏以备RT-PCR检测。2.3单因素应用全自动生化分析仪测定血清FBG、尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)、血肌酐(Serumcreatinine,Scr)、尿液尿蛋白(Urinaryprotein,Upro)和尿液微量白蛋白(Urinarymicrocontentalbumin,UmAlb);放射免疫法测定血清胰岛素(Insulin,Ins)。2.4in-：是否为hs-maun染色经10%中性甲醛固定的肾组织,常规脱水,石蜡包埋,制成厚3μm切片,行苏木素伊红(Haematoxylin-eosinstain,HE)染色,用于显示肾小球系膜细胞增生与毛细血管开放性。行马松三色(Masson)染色,用于显示肾小球系膜区和肾小管胶原增生情况。行过碘酸雪夫氏(PeriodicacidSchiff,PAS)染色,用于显示肾小球系膜细胞增生、肾小管肿胀与肾小管上皮细胞胞浆内糖原染色情况。2.5小鼠肝肾超微结构改变取肾皮质,剪成1mm2大小,2.5%戊二醛预固定,1%饿酸固定,常规处理,环氧树脂包埋,切片、染色、装片,20000倍电镜下观察肾小球毛细血管基底膜、足细胞、肾小管上皮细胞等超微结构改变情况并摄片。2.6u3000检测大鼠bmp-7-健康使用免疫组化过氧化物酶标记的链霉卵白素法(SP法)进行肾皮质BMP-7蛋白表达检测。左肾组织经10%中性甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,切片厚3μm,常规脱蜡、水化,置于柠檬酸(0.01mol/L,pH6.0)缓冲液中微波加热进行组织抗原修复,置于双氧水中室温孵育5min,滴加正常山羊血清(试剂A)室温封闭15min;滴加一抗兔抗大鼠BMP-7多克隆抗体[1∶200(V/V)稀释],室温孵育60min,PBS液冲洗,滴加二抗为生物素化的羊抗兔IgG(试剂B),37℃孵育15min,PBS液冲洗;滴加辣根酶标记链霉卵白素(试剂C),37℃孵育15min,PBS液冲洗;室温下滴加DAB显色剂,显微镜下观察显色效果,至棕黄色时用蒸馏水中止显色,苏木素轻度复染、脱水,二甲苯透明,树脂封片。光镜(400×)视野下,每组随机选取不重复的20个肾小球,由两人观察阳性细胞的分布与染色情况。参照Fromowitz综合计分法进行判定:总分=阳性细胞比例分值+染色强度分值。染色强度评定标准:阴性为0分;染色虽弱但明显强于阴性对照者为1分;染色强度中等者为2分;染色强者为3分。染色阳性细胞比例评定标准:阳性细胞数<5%为0分;5%~25%者为1分;26%~50%者为2分;51%~75%者为3分;>75%者为4分。两种评分相加,将结果分为4个等级:0~1分为(-);2分为(+);3~4分为(++);5~7分为(+++)。按综合评分的等级来评价切片指标变化情况。2.7rt-pcr扩增从大鼠右侧肾脏取肾皮质200mg,采用Trizol试剂严格按照说明书的步骤及要求提取总RNA,测得所提取的RNAA260/A280范围为1.6~2.0,且凝胶电泳显示18s和28s条带清晰,说明纯度良好。参照RT-PCR试剂盒操作规程合成25μlcDNA,PCR扩增BMP-7基因片段。PCR扩增反应条件:94℃变性4min,94℃30s,61℃60s,72℃60s,35个循环,72℃延伸10min。引物序列为BMP-7323bp:上游5′-AGACGCCAAAGAACCAAGAG-3′,下游5′-GCTGTCGTCGAAGTAGAG-GA-3′;内参GAPDH195bp:上游5′-CCATGGAGAAGGCT-GGGG-3′,下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。反应后取10μlPCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,Bandscan图像分析系统分析各条带吸光度,每组标本重复检测5次。BMP-7的相对表达量以BMP-7与GAPDH的光密度比值表示。2.8lsd和sak显著性检验法应用SPSS12.0统计软件,组间比较采用单因素方差分析(OneWayAnova),选择LSD和SAK显著性检验法,所有数据用x±s表示,以P<0.05表示差异具有统计学意义。免疫组化半定量分析采用Wilcoxon秩和检验法。3结果3.1各组大鼠血糖、体质量和尿量与正常对照组比较,模型组大鼠FBG、24h尿量和KW/BW均显著升高(P<0.01),体质量和Ins显著降低(P<0.01)。与模型组比较,Pue高、中、低剂量组大鼠FBG和KW/BW显著降低(P<0.01或P<0.05),大鼠体质量和Ins显著升高(P<0.01或P<0.05);Pue高、中剂量组24h尿量显著降低(P<0.01或P<0.05)。Pue对模型大鼠FBG、Ins、24h尿量、体质量、KW/BW的影响见表1。3.2pue对大鼠bun、scr、umalb的影响与正常对照组比较,模型组大鼠BUN、Scr、24hUpro、24hUmAlb显著升高(P<0.01)。与模型组比较,Pue高、中、低剂量组大鼠BUN、Scr显著降低(P<0.01或P<0.05);Pue高、中剂量组24hUpro、24hUmAlb显著降低(P<0.05)。Pue对模型大鼠血清BUN、Scr、24hUpro、24hUmAlb水平的影响见表2。3.3pue对模型中大鼠肾组织病理学形态的影响3.3.1小鼠小鼠基底膜增注效果正常对照组肾小球无明显病理改变,结构完整,毛细血管开放;模型组可见肾小球肥大,肾小球基底膜明显增厚,系膜区增宽,系膜细胞高度增生,呈弥散性分布、团块状聚集挤压毛细血管,毛细血管腔狭窄或闭塞;各用药组肾小球基底膜增厚程度显著改善,毛细血管腔狭窄程度明显减弱。Pue对模型大鼠肾组织病理形态学的影响见图1(HE染色)。3.3.2肾间质及炎症细胞浸养正常对照组肾组织染色部位主要位于基底膜、系膜区和肾小管间的毛细血管周围,肾间质无炎症细胞浸润及纤维化;模型组肾小管萎缩、管腔闭塞,肾间质有大量炎症细胞浸润,明显纤维化,亮绿色纤维组织增生;与模型组比较,各用药组肾间质纤维化程度均减轻。Pue对模型大鼠肾组织病理形态学的影响见图2(Masson染色)。3.3.3各组系膜细胞病变情况比较正常对照组肾小球结构完整,系膜区未见异常;模型组肾小球体积增大,呈分叶状,系膜区增宽,系膜细胞增生,间质浸润细胞逐渐增加,肾小管上皮细胞肿胀,呈玻璃样变,毛细血管腔狭窄或闭塞;与模型组比较,各用药组系膜细胞增生与毛细血管闭塞程度均有所减轻。Pue对模型大鼠肾组织病理形态学的影响见图3(PAS染色)。3.4小鼠足细胞融合模型正常对照组肾小球毛细血管袢结构清晰,基底膜厚度均匀一致,足细胞较完整,足突排列较整齐,与基底膜垂直;模型组肾小球毛细血管基底膜不规则增厚、系膜区扩张伴电子致密物形成,足细胞不完整,足突排列紊乱,部分形成融合;各用药组肾小球毛细血管基底膜增厚明显改善,足细胞较完整,足突排列较整齐,融合现象明显减轻。Pue对模型大鼠肾组织超微结构的影响见图4。3.5影响bmp-7蛋白和mrna在大鼠肾组织中的发现3.5.1各组大鼠输注后bmp-7蛋白表达比较模型组肾小球系膜细胞无或弱阳性表达;正常对照组肾小球着色部位广泛,以肾小球系膜细胞为主,呈强阳性表达,在部分肾小管上皮细胞及间质也有表达,且表达显著高于模型组(P<0.01);各用药组阳性染色部位与正常对照组相似,与模型组比较BMP-7蛋白表达均显著增强(P<0.01或P<0.05)。Pue对模型大鼠肾组织BMP-7表达的影响见图5、表3。3.5.2各组大鼠肾组织表达的bmp-7mrna表达比较BMP-7mRNA在正常对照组表达最强;与正常对照组比较,模型组肾组织BMP-7mRNA表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,Pue高、中、低剂量组和依那普利组能显著增加大鼠肾组织表达的BMP-7mRNA水平(P<0.01或P<0.05)。大鼠肾组织BMP-7mRNA凝胶电泳图见图6。4dn大鼠肾功能损害本实验通过STZ对大鼠胰岛B细胞的选择性破坏诱导DN模型,造模时每组动物数为14只,在实验过程中,由于血糖高以及感染等原因造成部分动物死亡,导致每组最后动物存活数均不一致。课题组前期研究发现,糖尿病成模后30d,模型动物已呈现出早期DN症状。本次实验按剂量50mg/kgip一次性给药,72h后大鼠血糖显著升高,98%大鼠血糖在13.8mmol/L以上,实验过程中模型组大鼠表现出精神萎靡、体质量明显减轻、反应迟钝、尾部坏死及典型的“三多”症状。因此,大剂量STZ复制DN模型是成功的。DN模型大鼠5周时,KW/BW增加,生化指标检测BUN、Scr、24hUpro及24hUmAlb均较正常对照组升高,Ins明显降低,提示DN大鼠肾脏细胞处于增殖和肥大状态,肾功能已严重减退。Pue各剂量组可逆转以上各项生化指标,对DN大鼠肾功能损伤有干预作用。DN是由糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常,Upro和UmAlb排泄率可灵敏地反映肾脏损害的程度,被用来作为DN诊断和预后判断的重要指标。依那普利为临床常用的第2代血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymeinhibitors,ACEI)类制剂,对糖尿病肾损害具有明确的保护作用。实验证明依那普利可降低Upro和UmAlb排泄率,减轻肾间质纤维化,同时还可以显著上调DN大