第5章 基因工程载体

第五章 基因工程载体携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体（vector），其本质是DNA（少数为RNA）。按功能分为克隆载体和表达载体。克隆载体主要用来克隆和扩增DNA片段，有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效的表达。（1）在寄主细胞中能自我复制，即本身是复制子；（2）容易从寄主细胞中分离纯化；（3）载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；（4）有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装；（5）能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；（6）用于表达目的基因的载体还应具有启动子（强启动子）、增强子、SD序列、终止子等。

作为基因工程所用的载体，需具有以下特性：第一节 质粒载体质粒载体是基因工程重要的载体之一。它是以质粒DNA分子为基础构建而成，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA文库。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造，从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。

一、质粒的一般生物学特性

1.质粒的概念质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体外的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状DNA（covalentclosedcircularDNA，cccDNA），少数是线性。质粒不仅仅存在于原核生物中，也存在于真核生物及其细胞器。除了酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是一种RNA分子外，其它所有质粒均为DNA分子。2.质粒DNA的构型

大多数质粒DNA是环状双链的DNA分子，具有三种不同的构型：①超螺旋构型（即supercoliedDNA，SC

DNA）（图C）；②开环DNA(opencircles，OCDNA)，此即OC构型（图B）；③线性分子（linearDNA，LDNA），通称L构型（图A）。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，由于插入的溴化乙啶（EB）量不同，因而具有不同的电泳迁移率，其中SCDNA的泳动速度最快，OCDNA泳动速度最慢，LDNA居中（图5-1）。3.质粒DNA的复制质粒的复制是受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制。环状质粒的复制主要有θ型复制和滚环复制两种形式。根据质粒控制拷贝数的程度，质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型(Stringentcontrol)和松驰控制型(Relaxedcontrol)。严紧型质粒是一种低拷贝数的质粒，只在细胞周期的一定阶段进行复制，与染色体复制同步，当染色体不复制时，也不能复制。松弛型质粒是一种高拷贝数质粒，在整个细胞周期中随时都可以复制，是独立于染色体进行复制的。通常小质粒为松弛型质粒，大质粒为严紧型质粒。在基因工程中，松弛型质粒更适合构建克隆载体。4.质粒的命名原则1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母“p”代表质粒（plasmid），在p字母后面用两个大写字母代表发现或构建这一质粒的作者或实验室名称，用数字代表构建的一系列质粒的编号。如pBR322就是按照这一标准命名的，其中“BR”则是分别来自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的首字母。

二、理想质粒载体的必备条件作为基因工程理想的质粒载体必须具备以下几个条件：（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。（2）带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。（3）具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。1.pBR322质粒载体1977年，F.Bolivar和R.L.Rodriguez构建了一个典型的用于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的。

pBR322质粒DNA分子的大小为4363bp，分子量为2.6×106dal。具有ColEI松弛型复制子，在每个E.coli细胞中维持约20个拷贝。含有选择标记基因氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。

三、常用的质粒载体由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：（1）具有较小的分子量。不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段。（2）具有两种抗生素抗性基因，供作转化子的选择记号。可以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。（3）具有较高的拷贝数。经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000～3000个拷贝，这为重组体DNA的制备提供了极大的方便。3.pUC质粒载体1987年，美国加利福尼亚大学（UniversityofCalifornia）的科学家J.Messing和J.Viria在pBR322质粒基础之上构建了一种广泛使用的新型质粒载体即pUC系列质粒载体。包括PUC8/9、PUC18/19、PUC118/119等。

pUC系列的质粒载体通常是成对构建的，二者的差别仅在于多克隆位点的方向相反。设计这样一对质粒克隆载体，便于用限制性核酸内切酶切割产生的一个DNA片段以正、反两个方向插入克隆载体，保证DNA片段中基因的信息链与质粒克隆载体信息链连接，进行有效的表达。

一种典型的pUC系列质粒载体包括以下四个组成部分：（1）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（2）氨苄青霉素抗性基因（Ampr），但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含原来的限制性核酸内切酶切割位点；（3）大肠杆菌

-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码

-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ

基因；（4）位于lacZ

基因中的靠近5

端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它的存在并不破坏该基因的功能。

pUC质粒载体可以选出在克隆载体中已插入了外源DNA片段的重组子，这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选pUC18质粒载体优点：

第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数。第二，适用于组织化学方法检测重组体。第三，具有MCS区段。pUC18质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。第二节噬菌体载体噬菌体（bacteriophage，简称phage）是一类细菌病毒的总称。利用重组DNA技术构建的以噬菌体为主体的载体，就是噬菌体载体。与质粒相比，噬菌体结构要复杂些，病毒颗粒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白质组成，其DNA分子上除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体感染细胞比质粒转化细胞更为有效，而且噬菌体的克隆容量也明显大于质粒的。一、噬菌体的生物学特性噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸可能存在各种形式。不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，可分为3种类型。大多数噬菌体是具尾部结构的二十面体，头部下端连接着一条尾部结构，看起来像是一种小型的皮下注射器，如T4噬菌体。另两种类型是无尾部结构的二十面体型和线状体型。噬菌体的感染效率极高。一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后，便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒，每一个子代颗粒又各自能够感染一个新的细菌细胞，再产生出数百个子代颗粒，若是在琼脂平板上感染生长的细菌，则是以最初被感染的细胞所在位置为中心，慢慢地向四周均匀扩展，最后在琼脂平板上形成明显的噬菌斑，也就是感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的圆形透亮空斑a噬菌体增殖的第一步是吸附到寄主细胞上，同一个细胞可以同时吸附一个以上的噬菌体颗粒；b噬菌体的DNA注入到感染的寄主细胞内；c噬菌体DNA大量增殖；d子代噬菌体颗粒的组装；e寄主细胞溶菌，释放出大量的新的噬菌体颗粒；f噬菌体的DNA从寄主染色体DNA删除下来；g溶源性细胞通常按照正常细胞的速率进行分裂噬菌体的生活周期有溶菌周期和溶源周期两种不同类型。其中把只具有溶菌周期的噬菌体称为烈性噬菌体（virulentphage）。把既能进入溶菌周期又能进入溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体（temperatephage）。、λ噬菌体载体λ噬菌体载体（lambdaphagevector）是最早使用的克隆载体之一，构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。同时，其也是迄今为止研究的最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，在重组DNA的研究中有着相当广泛的应用。

外形特征类似于蝌蚪，由头和尾组成。头部呈等轴的20面体，直径约54nm，λDNA被包裹在其中；尾部无尾鞘，长150nm，主要由衣壳蛋白组成。1．λ噬菌体载体的生物学特性λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。由DNA（λDNA）和外壳蛋白质组成。λ噬菌体具有溶菌和溶源两条生长途径。λ噬菌体DNA是一条线性双链DNA分子，长度为48502bp。在其两端的5

末端各带有一个长为12个碱基（序列为5GGGCGGCGACCT3

）的单链互补黏性末端。一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环状DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesiveendsite）。随后环状DNA的两切口在宿主细胞的DNA连接酶和促旋酶的作用下，形成封闭的环状双链，充当转录的模板。2.λ噬菌体载体的构建在基因工程中，λ噬菌体载体是最主要的一种载体。然而野生型的λ噬菌体并不适于直接用作基因克隆的载体，必须对野生型λDNA进行改造使之成为理想的基因克隆载体。

λ噬菌体基因组人为地划分为三个区域：（1）左侧区，从基因A到基因J，包含外壳蛋白质的全部编码基因；（2）中间区，介于基因J到基因N之间，这个区又称为非必需区，包含了一些与重组有关的基因，以及使噬菌体整合到染色体的int基因，和把原噬菌体从寄主染色体删除下来的xis基因；（3）右侧区，位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因以及噬菌体的复制基因（O、P）和溶菌基因（S、R）。对野生型的λ噬菌体的改造主要包括以下几个方面：（1）去除λDNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。（2）去除多余的限制酶切割位点，确定1～2个单酶切位点作为克隆位点。（3）λDNA的非必需区组入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。λ噬菌体载体中主要利用λ噬菌体的生物学特性来做选择标记。主要有cI基因失活、Spi筛选、lacZ基因失活。

（4）建立重组的λDNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。3.λ噬菌体载体种类两种不同的类型：插入型载体（insertionvector）和置换型载体（replacementvector）。

置换型载体：允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体，称为置换型载体，又称取代型载体（subtitutionvectors）。这类载体是在λ噬菌体基础上改建而成，由左臂、右臂以及左右臂之间的一段填充片段组成，其中左臂包含使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb；右臂包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb；中间填充片段约长18kb，这一段DNA可以被外源片段置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。插入型载体又分为两种类型：①cI基因插入失活：在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点，外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。利用不同的噬菌斑形态作为筛选重组体的标志。②LacZ基因插入失活：在非必需区段引入lacZ基因，在LacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝斑白筛选）。4.柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmidvector）是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体，也称为粘粒载体，即由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成。（1）柯斯质粒载体的构成柯斯质粒载体是一种环状双链DNA分子，大小为4～6kb。它由4部分组成，包括质粒的复制起点、一个或多个限制性核酸内切酶的单一切割位点、抗性标记基因和λ噬菌体的黏性末端片段。来自λDNA部分的片段除了提供cos位点，在cos位点两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列，这样就能够包装成有感染性的噬菌体颗粒。

（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体，柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：

第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。（3）柯斯质粒载体克隆基因的基本程序柯斯质粒载体具有质粒载体的性质，可以按照一般质粒克隆载体进行操作，转化宿主细胞，可在宿主细胞内进行自我复制。第三节其它载体一、酵母载体以重组DNA技术重新修饰构建的酵母作为载体，即酵母载体。目前，人们已构建了许多酵母质粒载体，根据质粒的复制方式不同，把它们分为几个不同的种类。

1.整合型载体(integrativeyeastplasmidvectors，YIp）复制型载体（yeastreplicatingplasmid，YRp）着丝粒型载体（yeastcentromere-containingplasmid或yeastcentromereplasmid，YCp）附加体型载体（又称游离型质粒，yeastepisomalplasmids或yeastextrachromosomalplasmid，YEp）等。以上几种类型的载体，它们共同的特点是：（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。整合型载体（YIp）

YIp型载体比较简单，属于穿梭质粒、自我复制型载体，由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。YIp型载体含有4个主要部分：①多克隆位点；②抗氨苄青霉素基因Ampr；③大肠杆菌复制起点；④尿嘧啶原养型基因Ura3+，在酵母菌第V染色体上有Ura3+的同源顺序，通过交换可将YIP整合到第V染色体中。2.复制型载体（YRp）YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，其中酵母DNA片段不但提供了选择标记，还携带有来自酵母染色体DNA的自主复制顺序（ARS）。YRp型载体既含有大肠杆菌的复制起始区和选择标记Ampr，又含有酵母的复制起始区和选择标记Leu2+。它可以转化大肠杆菌Amps细胞，也可以转化酵母Leu细胞。该载体的这一功能是非常有用的。

3.附加体型载体（YEp）YEp型载体是一种罕见的真核细胞质粒载体，一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。YEp型载体pYF92就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。由上可以看出，在使用酵母中的克隆载体时都存在着稳定性与拷贝数之间的矛盾。能稳定遗传的（YIp，Ycp）都是单拷贝，而拷贝数高的（YRp、YEp）又都不稳定。因此在基因操作中，要根据不同的使用目的进行选择和改造载体。若在YRp型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区，构成了酵母着丝粒型载体，由于着丝粒区的作用，这类载体在供体细胞中的行为类似染色体，能够稳定遗传，但以单拷贝存在，因此由供体细胞重新获得YCp质粒则比较困难。酵母人工染色体（YAC）YAC是目前能克隆最大DNA片段的载体，可插入100～2000kb的外源DNA片段。

YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复