慢性再生障碍性贫血中医辨证分型与fas、fasl抗原表达的相关性研究

慢性再生障碍性贫血中医辨证分型与fas、fasl抗原表达的相关性研究

异常恶性贫血患者骨髓sd-34细胞过度死亡是其数量或质量缺陷的原因之一。fas-fasl死亡系统参与了促进再生障碍骨髓cd-34细胞死亡的过程。Fas和FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)家族成员,以膜结合蛋白或可溶性分子两种形式存在,与其信号转导途径中的许多细胞内外因子共同组成Fas/FasL系统,在维持组织正常发育、控制免疫反应、调节机体生理平衡中起着重要作用,并参与机体细胞免疫,Fas与FasL相结合,可诱发细胞凋亡。本研究旨在探讨慢性再生障碍性贫血中医不同证型间存在Fas/FasL的差异,阐明该病中医辨证分型的物质基础。1数据和方法1.1肾阳虚型、肾阴阳两虚型90例慢性再生障碍性贫血患者均为中国医学科学院血液病研究所血液病医院、天津中医药大学第一附属医院、山东中医药大学第一附属医院2005年2月至2006年2月收治的住院和门诊患者。其中,脾肾阳虚型者30例,男性17例,女性13例,年龄16~64岁,平均(38.40±4.96)岁,病程27d~11年,平均(5.73±1.90)年;肾阴阳两虚型者30例,男性15例,女性15例,年龄17~68岁,平均(31.07±3.820)岁,病程15d~9年,平均(4.69±1.83)年;肝肾阴虚型者30例,男性16例,女性14例,年龄18~65岁,平均(38.06±3.71)岁,病程52d~14年,平均(6.28±2.13)年。另选15例健康志愿者为正常组,其中男性6例,女性9例,年龄16~60岁,平均(33.16±4.17)岁。1.2患者辨证的一般情况西医诊断标准参照张之南主编《血液病诊断与疗效标准》。中医辨证分型标准参照1989年6月大连全国中西医结合血液病专业委员会第三届第二次学术会议拟定的慢性再生障碍性贫血中医辨证分型标准及《实用中医血液病治疗学》、《血液科专病中医临床诊治》,并结合临床实践经验、前期研究基础,将确诊的慢性再生障碍性贫血患者辨证分为脾肾阳虚型、肝肾阴虚型、肾阴阳两虚型。脾肾阳虚型:面色苍白,口唇淡白,形寒肢冷,气短懒言,食欲不振,腰膝酸软,面浮肢肿,夜尿频数,大便溏泻,舌淡胖嫩,苔白,脉沉细无力;肝肾阴虚型:面色苍白,神疲乏力,心悸气短,头晕耳鸣,目涩,胁痛,失眠多梦,五心烦热,颧红盗汗,腰膝酸软,遗精或精少,或鼻衄、齿衄、肌衄,舌红少苔,脉细数;肾阴阳两虚型:面色白,唇甲色淡,头晕目眩,心悸气短,乏力倦怠,畏寒肢冷,腰膝酸软,自汗盗汗,手足心热,舌淡苔白或舌红少苔,脉沉细或沉细略数。1.3实验材料1.3.1rt-pcr一步法试剂与方法淋巴细胞分离液,天津灏洋生物制品科技有限公司;无酚红RPMI1640培养液,美国Gbico公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司产品;Fas(CD95-FITC)、FasL(CD178-BIOTIN)、IgG-FITC、PI,美国BD公司;RNase-free离心管、200μl和1000μlTips、Tris、DEPC,美国Sigma公司;RT-PCR一步法试剂盒、溴化乙啶(EB)、引物合成、核酸标准分子量Marker、EDTA、琼脂糖、PCR小管、1.5ml离心管(RNasefree),宝生物工程有限公司;TRIZOLReagent,Invitrogen公司。1.3.2材料、试剂与仪器高速离心机ALLEGRA-64R、低温高速离心机Universal16R、紫外分光光度计UV2401,美国Beckman公司;流式细胞仪,美国BD公司;PCR扩增仪(HYBAID),英国Hybaid产品;电泳仪(EC250-90)、水平电泳槽(DYY-Ⅲ32),北京六一仪器厂。1.4检测方法1.4.1无酚红吸附法检测细胞培养细胞的活性常规无菌采集骨髓5ml,肝素抗凝。用10ml离心管,先注入5ml淋巴细胞分离液,再将骨髓液缓缓注入,使其浮于分离液上层;水平离心1500r/min,20min;将离心管垂直缓慢移入超净工作台,用毛细吸管仔细吸取中间白色悬浮层,移入另一支离心管中,加入5mlPBS液;水平离心1000r/min,10min;倒去上清,加入5mlPBS液,水平离心1000r/min,10min;倒去上清,加入5ml无酚红RPMI-1640培养基,混匀呈悬液;吸取500μl,移入Ependoff管,加入2%台盼蓝500μl,混匀呈悬液,取500μl,注入计数板,在倒置显微镜下计数,将活细胞终浓度调至2×105/L;吸取5ml,加入培养瓶中,置于37℃5%CO2的孵箱中过夜;吸出培养液,水平离心1000r/min,10min;倒去上清,加入4ml培养基,1mlPHA-P,放入孵箱中72h;吸出培养液,水平离心1000r/min,10min,收集培养上清及BMMNC,置于-80℃冰箱保存待测。1.4.2lysingso共同作用将CD95-FITC、IgG-FITC各10μl分别加入两个试管中;CD178-BIOTIN和PI各10μl分别加入两个试管中;在5个试管中分别加入100μlBMMNC,室温下避光孵育15~30min。加入2ml1×Lysingsolution(细胞溶解液)混匀,室温下避光5~10min,离心5min,1200r/min。倒掉1×Lysingsolution悬浮细胞,加PBS(含0.5%BSA)2ml洗涤,离心5min,1200r/min。倒掉PBS悬浮细胞,补足0.5mlPBS或1%多聚甲醛,上流式细胞仪检测。1.4.3ctg-3,fas,l按试剂盒说明书,提取骨髓单个核细胞总RNA,进行RT-PCR反应(逆转录—聚合酶链反应)。特异性RT-PCR引物[8~9]:Fas:L:5′-ATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTA-3′,R:5′-TCTGCACTTGGTATTCTGGGTCCG-3′,384bp;电泳后,在凝胶成像系统分析仪下摄片、分析,以照片和条带亮度的比值为最后的结果,比值X=样品特异基因的PCR扩增反应产物亮度/该样品β-actin的PCR扩增反应产物亮度。1.5统计方法2结果2.1高p>0.1慢性再生障碍性贫血患者Fas抗原的表达较正常对照显著增高(P<0.01);脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组与肝肾阴虚组组间比较有显著性差异(P<0.01)。两种抗原阳性率从低至高依次为脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组与肝肾阴虚组(表1)。2.2fas、faslmrna表达情况慢性再生障碍性贫血患者骨髓Fas、FasLmRNA均比正常对照组高表达,均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);其中,脾肾阳虚组Fas、FasLmRNA表达与正常对照组比较差异显著(P<0.05);肾阴阳两虚组、肝肾阴虚组与正常对照组比较差异显著(P<0.01);肾阴阳两虚组与肝肾阴虚组FasLmRNA表达差异显著(P<0.05)。3种证型之间,以肝肾阴虚组表达最强,脾肾阳虚组表达最弱,肾阴阳两虚组介于两者之间(见图1~图3,表2)。3fas基因表达与再障关系近年来,对免疫细胞的凋亡进行了较深入的研究,发现多种免疫细胞表面抗原及胞内物质都参与或调节细胞凋亡的发生,其中死亡分子与其受体结合在诱导凋亡、维持机体自身稳定和保持内环境平衡方面起着关键性作用。Fas又称Apo-1,现命名为CD95分子,属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体(NGFR)家族成员,是一种Ⅰ型细胞膜蛋白。FasL(Fas配体)为TNF相关的Ⅱ型跨膜蛋白,与TNF家族成员高度同源,FasL主要表达在活化的T细胞和NK细胞上。Fas主要以膜受体的形式存在,还存在可溶性Fas。目前发现人有5种可溶性Fas(sFas),它们都可抑制Fas介导的凋亡,起负性调控作用。Fas表达于成熟的T细胞、B细胞等多种细胞类型。Fas与其相应抗体或其自然配体(FasL)结合,通常能诱发细胞凋亡。细胞毒T淋巴细胞(CTL)在Fas诱导的凋亡中起着重要作用,认为活化后的CTL表达FasL,从而特异性地识别Fas阳性的细胞,使Fas与FasL相互结合,启动Fas死亡信号使靶细胞凋亡[14~16]。已有研究证实,Fas/FasL介导细胞凋亡在再障中起重要作用。徐淑芬等在研究中发现,慢性再生障碍性贫血患者Fas表达率高于正常对照组(P<0.01),从而证实骨髓Fas表达率增高与再障发病有关。我们应用流式细胞仪检测慢性再生障碍性贫血患者骨髓Fas抗原、FasL抗原。结果显示慢性再生障碍性贫血患者Fas抗原的表达较正常对照组显著增高(P<0.01);脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组和肝肾阴虚组组间比较有显著性差异(P<0.01)。慢性再生障碍性贫血3种证型FasL阳性率均高于正常对照组(P<0.01),并且组间比较差异显著(P<0.01)。两种抗原阳性率从低至高依次为脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组与肝肾阴虚组。Fas抗原与FasL抗原存在正相关,但同一研究对象的Fas阳性率均高于FasL抗原的阳性率。可以考虑为Fas在成熟T淋巴细胞中就有基础表达,在激活的T淋巴细胞中表达增加,而FasL仅表达在活化的T淋巴细胞。为了验证上述结果,我们又采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测慢性再生障碍性贫血患者骨髓Fas、FasLmRNA表达。结果:慢性再生障碍性贫血患者骨髓Fas、FasLmRNA均比正常对照组高表达,均有统计学意义(P<0.05;P<0.01),与国外报道一致;其中,脾肾阳虚组Fas、FasLmRNA表达与正常对照组比较差异显著(P<0.05);肾阴阳两虚组、肝肾阴虚组与正常对照组比较差异极显著(P<0.01);脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组与肝肾阴虚组Fas、FasLmRNA表达两两比较差异显著(P<0.05;P<0.01)。3种证型之间,以肝肾阴虚组表达最强,脾肾阳虚组表达最弱,肾阴阳两虚组介于两者之间。Fas、FasL被认为是凋亡的诱导因子。Fas和FasL在慢性再障患者骨髓中从阳性率、基因表达均高于正常对照组,脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组、肝肾阴虚组依次增高。Fas与FasL结合是Fas在体内发挥作用的唯一途径。Fas只是在与FasL结合后,才能诱导Fas形成能转导信号的三聚体,即可诱导表达Fas的细胞发生凋亡。Fas、FasL在慢性再障患者中高表达,诱导造血细胞凋亡,使造血细胞数量减少,外周血象降低,而在慢性再障3种证型间存在表达量的差异,故Fas/FasL介导的凋亡系统指标(Fas、FasL)可作为慢性再障中医辨证分型的依据。再生障碍性贫血属于骨髓衰竭综合征,慢性再生障碍性贫血骨髓中造血干细胞通过细胞凋亡而减少,骨髓基质中造血调控因子促进干细胞表达Fas抗原而加速凋亡。深入研究Fas和FasL在生理和病理情况下表达的调控,将有助于明确Fas/FasL系统介导的凋亡在慢性再生障碍性贫血的发病和治疗方面所起的作用;同时与中医不同证型结合起来研究,既阐明慢性再生障碍性贫血同病异证的科学内涵,又为探讨