分子杂交印迹技术

分子杂交印迹技术SouthernblottingEdwinSouthern在1975年提出的分子印迹概念，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列

Northernblotting1977年，GeorgeStark等发明，检测RNA1979年，GeorgeStark发展出早期的蛋白印迹技术，将蛋白从电泳凝胶上转移到活化的纤维素上随后，HarryTowbin发展出更快速、简单的电转技术。1981年，W.NealBurnette正式将这一技术命名为“WesternBlot”。（Nowinski

ofWestCoast）

Westernblotting

Western免疫印迹电泳转移杂交显色限制性内切酶酶切DNA溶液

RNA样品蛋白质样品转移到NC膜后与标记的探针杂交转移到NC膜or尼龙膜后与标记的探针杂交转移到NC膜orPVDF膜后与标记的探针杂交DNA印迹RNA印迹蛋白质印迹免疫技术Westernblotting（免疫印迹技术）免疫组化Elisa

(enzyme-linkedimmunosorbentassay)三种免疫技术的比较检测样本样本处理电泳固相载体转印显色观察检测目的免疫印迹蛋白质混合溶液中目的蛋白SDS

NC膜、PVDF膜湿转、半干转化学、荧光扫描仪定性免疫组化细胞或组织固定、包埋、切片、脱蜡、水化

载玻片化学显微镜定位Elisa血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液微孔板化学酶标仪定量免疫印迹（WesternBlot）的目的？

目的蛋白是否存在在样品当中；蛋白质的分子大小；

分子量的改变；蛋白质的表达情况：上调或下调？在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。WesternBlot检测蛋白的优势相对看家蛋白的校正定量的重要性首先它消除了每个通道上相同的样品量的不确定性和误差，有时候我们在上样的时候会发生样品丢失，样品中的看家蛋白就可以起到归一化校正，从而可以精确的定量目的蛋白

它消除了膜上探针的剥离和再杂交的不确定性。因为在剥离和再杂交的过程中，会丢失掉许多蛋白的信息，这往往是非常难以控制的

可以更精确定量总蛋白里的磷酸化蛋白，如非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白的比较

免疫印迹（WesternBlot）的基本原理免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质组分经SDS分离后，平行转移到固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

免疫印迹（WesternBlot）的基本原理

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是一抗，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶、同位素或红外荧光标记的二抗反应，经过底物显色、放射自显影或红外荧光扫描仪检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot的基本步骤WesternBlot的检测结果免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤(一)蛋白质样品的制备：

裂解液裂解超声煮沸冷冻免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤1组织的处理方法：PBS洗涤，液氮研磨，180W，6min，0℃超声波破碎，5000rpm，离心5min，取上清。加入上样缓冲液煮沸5min，-20℃分装保存

2细胞的处理方法：离心收集细胞，PBS洗涤，180W,6min，0℃超声波破碎，5000rpm，离心5min，取上清。也可以直接加入细胞裂解液，0℃裂解20min，加入上样缓冲液煮沸5min，分装后于-20℃保存使用前加入1-4mMPMSF裂解液

►1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5ml

►NaCl0.438g

►TritonX-1000.5ml

►蒸馏水至50ml

►混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml50mMTris-HClpH7.4150mMNaCl1mMEDTA1%Tritonx-1001%脱氧胆酸钠0.1%SDS

使用时加入PMSFRIPA（radioimmunoprecipitationassay）裂解液蛋白定量方法

Bradford法（考马斯亮蓝法）BCA法

定氮法紫外吸收法

Lowry法（Folin-酚试剂法）考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。

操作方法1.标准曲线制作取10支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

标准蛋白(uL)051015202530待测蛋白质溶液(uL)NS(uL)100959085807570考马斯亮蓝(uL)900900900900900900900900900900

混匀，595nm处测定OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法（Bradford法），它的原理是考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。与其他几种方法比较有很多突出优点，因而得到广泛的应用。Bradford法实验原理1.灵敏度高比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。2.测定快速、简便由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。3.干扰物质少如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

Bradford法的优点Bradford法的缺点

1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时选用G-球蛋白(通常用BSA)为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2.仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂如TritonX-100、SDS和0.1N的NaOH3.标准曲线也有轻微的非线性，因而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。BCA法实验原理Bicinchoninicacid(BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。BCA法试剂的配制1.试剂A：1％BCA二钠盐

2％无水碳酸钠

0.16%酒石酸钠

0.4％氢氧化钠

0.95％碳酸氢钠混匀，pH值：11.25

2.试剂B：4％硫酸铜

3.BCA工作液：试剂A:试剂B=50:1

4.蛋白质标准液：BSA，1mg/ml标准曲线的绘制

试剂１２３４５

空白管测定管蛋白质标准液(1.5mg/ml)

05102040双蒸水(mg)10095908060待测样品(mg)100BCA工作液(ml)2222222BCA法优点1.

操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；2.准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。

3.经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；

4.抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响；

缺点是工作液的配制比较麻烦。

特点免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤（二）电泳：制备不连续电泳凝胶，进行SDS

Tris/GlycineSDS通常在不连续缓冲系统中进行，其电泳缓冲液的pH值与离子强度不同于制胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推动，样品通过浓缩胶后，复合物在分离胶表面凝聚成一很薄的区带。由于不连续缓冲系统具有把样品中的成分全部浓缩成很小体积的能力，故大大提高了SDS的分辨率。（二）电泳：制备不连续电泳凝胶，进行SDS

1.分离胶的配制(15ml)：(12%分离胶)ddH2O：4.9ml30%储备胶：6.0ml1.5MTris-HCl：3.8ml(pH8.8)

10%SDS：0.15ml

10%AP：0.15mlTEMED：6μl2.浓缩胶的配制(4ml)(4%浓缩胶)ddH2O：2.8ml30%储备胶：0.66ml1.0MTris-HCl：0.5ml(pH6.8)

10%SDS：0.04ml

10%AP：0.04mlTEMED：4μl免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤3.上样4.电泳上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板垂直电泳装置免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤（三）转移：

1胶条平衡20min;

2膜平衡20min;

3转膜：恒流1mA/cm2，转移1.5hr;4标记膜免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤（三）转印

放置顺序如下：

阴极（顶部）三层转印缓冲液浸湿的吸水纸用转印缓冲液浸湿聚丙烯酰胺凝胶转印缓冲液浸湿的硝酸纤维素膜(PVDF膜)三层转印缓冲液浸湿的吸水纸

阳极(底部)●考马斯亮兰染色转印结束后,将凝胶放入平皿中,加入考马斯亮蓝染色液。室温下振摇20min。去除染色液,收集保存可重复使用多次。●脱色

免疫印迹（WesternBlot）的基本步骤（四）免疫反应：

1、封闭非特异性的结合位点，室温封闭1-2小时或

4℃过夜。2、一抗与抗原反应。

3、二抗与一抗反应。

4、显色Odyssey扫描结果实验室常用的几种检测方法化学发光（显色）底物显色（显色）红外荧光扫描（Odyssey扫描)DAB显色法原理：DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。

化学发光法（ECL）

原理：在二抗上偶联辣根过氧化物酶，然后加入底物。底物在酶的作用下，可以发出很强的光信号，在暗房中可对X-光片感光。化学荧光法

原理：通过在二抗上标记荧光染料，在相应仪器设备上通过固定波长激光激发后系统采集染料发出荧光信号。

WesternBlot常见检测方法

不同检测方法比较DAB显色法操作简便，无需暗房和显影设备，显色直观，最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP，但灵敏度较低，国外已不常见。化学发光法（ECL）比底物显色法灵敏度高，可达ng水平。但由于是酶促反应，不同曝光时间得到的信号与样品量不成线性关系。定量不够准确。化学荧光法操作简单，信号持久，可进行精确定量不同检测方法比较Odyssey:膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像ECL:膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+

UVP扫描成像化学发光法

1）将两种显色底物1：1等体积混合。

2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

底物显色法

辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释），平稳摇动，室温2hr。弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。

Odyssey进行扫描封闭室温封闭1-2小时或4过夜。封闭液稀释的一抗中孵育。用PBS-T摇床洗膜。封闭液稀释的二抗中孵育，膜在二抗中室温振荡2小时，洗膜（避光）。用PBS洗去膜上残留的Tween-20，直接通过Odyssey进行扫描。Odyssey扫描结果700nmchannel800nmchannel700and800OverlayOdyssey扫描双色成像

可用两种不同波长的红外染料对不同的生物分子（蛋白或核酸）标记和同时检测，杂交检测条件均等，数据对比性强，结果直观。两种染料的最大发射波长相差100nm，无光谱重叠，因此可用于进行两种信号间精确的量化分析。红外荧光扫描成像系统"TheOdysseyreallyspeedsupourapplication,sowegetfasterresults.Ihaven'tusedECLeversincetheOdysseyarrived." -StanimirIvanov,BrownUniversity实验结果MarkerS1S2S3S4MarkerS1S2S3S4Odyssey结果

ECL结果

结论Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大Odyssey扫描图能同时看到Marker和目标蛋白，ECL看不到Marker微孔板In-CellWestern分析

利用Odyssey红外成像系统进行的ICW是高通量信号传导通路分析和药物筛选的最佳选择。Odyssey可以直接对96或384孔板内的细胞内蛋白进行精确的定量检测。ICW使用红外标记的二抗直接标记细胞内蛋白，量化微孔板每个孔内的荧光信号。不仅节约时间，提高检测效率，还避免了传统WB易出错的操作步骤，例如裂解细胞、凝胶电泳和转膜等。微孔板In-CellWestern分析

OdysseyICW软件可用来扫描微孔板、样品定位、精确定量以及数据分析。每个检测通道的荧光图像可独立显示，并采用不同颜色（红色和绿色）。当两个图像相互重叠时，通过颜色的变化可计算蛋白的修饰化程度。

微孔板In-CellWestern分析

In-CellWesternDetection

In-CellWesternAnalysis

注意事项：

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加H2O2。

3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。4、Odyssey进行扫描时，封闭时切勿加入Tween-20，在未结束封闭之前膜不能和Tween-20有任何接触，否则会造成背景过高In-GelWesternDetection电泳后无须转膜

异丙醇预处理胶

抗体1and2孵育洗涤

直接扫描In-GelWesternDetectionOdysseyIn-GelWesternChemiluminescentIn-GelWestern

系列稀释的转铁蛋白做抗原，兔抗转铁蛋白一抗，Alexa680标记的羊抗兔二抗（Odyssey)化学发光法是用辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）标记的

羊抗兔二抗.

NotransferorblockingNoexpensivekitsIdealfordetectinghard-to-transferproteinsQualitativedetectionWesternblot常见问题

1、一抗如是多抗，可以试着降低一抗的浓度，如一抗是单抗，可适当降低二抗的浓度

2、最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2小时室温封闭，时间允许可4℃过夜封闭

3、洗膜一定要充分,一般PBS-T10分钟3次，DAB显色时，背景过深，DAB显色时间不要过长，一般2分钟足矣。

4、设阴性和阳性对照。这样出来的带该在哪个位置，不该在哪个位置一目了然

杂带多胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐Westernblot常见问题转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？

可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温Westernblot常见问题背景太高膜或者缓冲液污染封闭不充分膜没有均匀浸湿抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高

原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度Westernblot常见问题Westernblot常见问题1、技术问题（1）电泳（2）转膜2、抗体问题（特异性、浓度）3、蛋白质丰度4、荧光淬灭没有条带1、背景过深2、抗体特异性3、洗膜时间Westernblot常见问题Westernblot常见问题1、加样量2、ECL试剂3、曝光时间Westernblot常见问题蛋白质降解？内参Westernblot常见问题4：加样量过多6：加样量偏少Westernblot常见问题

免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些是线性的，而有的属于构象型。线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识