热应激对奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mrna转录的影响

热应激对奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mrna转录的影响

热态是指身体在环境温度下产生的非特异性反应。高温可以诱导奶牛产生应激,引起一系列复杂的生理生化反应。研究应激机制,探寻应激敏感指标及其调控过程,是减少奶牛热应激造成的损失的关键所在。近年来,对热应激的研究已经深入到细胞水平,对小鼠肝细胞、人血管内皮细胞、奶牛外周血淋巴细胞等细胞的热应激研究有了相关报道。热应激能降低细胞的活力,诱导细胞凋亡。同时,热休克蛋白(HSPs)作为细胞受到各种刺激时产生的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族,在高温处理条件下可被诱导表达,并使细胞产生热耐受性,从而最大限度地降低高温对细胞的损伤。并且研究还发现,细胞的热应激调控过程因细胞类型、温度、作用时间的不同而存在差异。杜鹃和郭亮等报道了单一和连续间断的高温处理对奶牛乳腺上皮细胞生长和凋亡的影响,研究发现高温可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究以在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,对细胞进行持续高温处理,采用台盼蓝染色、细胞流式、RT-qPCR等方法研究热应激对乳腺上皮细胞生长、凋亡及热休克蛋白mRNA转录的影响,从而发现奶牛乳腺热应激反应的生物学变化,为缓解奶牛热应激和提高奶牛的生产性能提供参考。1材料和方法1.1牛奶乳腺癌上皮细胞的-结构测定参照王治国和Hu等的方法将分离纯化后的奶牛乳腺上皮细胞,通过检测细胞中角蛋白-18进行鉴定后,用RT-qPCR和Westernblotting方法检测奶牛乳腺上皮细胞的β-酪蛋白分泌,并分析染色体数目,绘制细胞生长曲线,证明体外培养的奶牛乳腺上皮细胞处于正常的生理状态和分泌功能,在体外培养的过程中没有发生转化。奶牛乳腺上皮细胞使用培养基(DMEM/F12+10%FBS)悬浮,并以大于2×105个的数量移入培养皿(Corning,430165)中,置于38℃的5%CO2培养箱中培养至细胞贴壁达80%~90%时,用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。1.2细胞计数和独立计数将奶牛乳腺上皮细胞以约1×104个·孔-1的浓度接种于24孔板(Corning,3524)中,分别置于38和42℃进行培养,采用台盼蓝染色法每天进行1次细胞计数,每天设3个独立重复,连续7d。未计数组每2d换液1次,绘制生长曲线。1.3细胞凋亡的检测将奶牛乳腺上皮细胞以约1×105个·孔-1的浓度接种于12孔板(Corning,3513)中,培养大约48~72h,观察每孔细胞贴壁80%~90%后,分别置于38和42℃培养1、3、5和8h,采用AnnexinV-FITCKIT(EPIGENLot:030920)检测细胞凋亡。其主要过程为:①用D-Hank′s液清洗细胞2次,每次1mL;②用不含EDTA的胰酶消化收集,对细胞计数,每0.1mL样含1×105~5×105细胞;③用400μLBindingBuffer悬浮细胞;④分别加入5μLAnnexinV-FITC和PropidiumIodide,混匀;⑤室温避光反应10min;⑥用流式细胞仪(EasyCytemini,Guava)检测,AnnexinV-FITC用绿色荧光FITC通道(FL1)检测,PI用红色荧光通道FL3检测。1.4细胞rna的提取将奶牛乳腺上皮细胞以约1×105个·孔-1的浓度接种于12孔板中,培养48~72h,观察每孔细胞贴壁80%~90%后,分别置于38和42℃培养12h后提取细胞RNA,每个处理3个重复。1.4.1样品处理和离心采集采用RneasyMiniKit(QIAGEN)提取细胞RNA,其主要过程为:①用D-Hank′s溶液清洗细胞;②在12孔板中每3个孔加入约350μLBufferRLT吹吸均匀,转移至1.5mL离心管后静置;③加入等体积的70%乙醇吹吸均匀(不可离心);④将700μL样品转移至核试剂柱中(放于2mL收集管中)于>10000r·min-1离心15s,丢弃流通物;⑤往柱上加700μLBufferRW1,同样的速度离心15s,然后丢弃流通物;⑥往柱上加500μLBufferRPE(事先用4倍体积乙醇稀释),以同样速度离心15s,丢弃流通物;⑦往柱上加500μLBufferRPE,以同样速度离心2min;⑧换新2mL收集管,全速离心1min;⑨换新的1.5mL收集管,往柱上加20μL无Rnase水,以>10000r·min-1离心1min来洗脱RNA;⑩往柱上加20μL无Rnase水,以>10000r·min-1离心1min,再次洗脱RNA。提取RNA以后用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测,并用紫外分光光度计Nanodrop测定RNA浓度。1.4.2random反应采用反转录试剂盒(TIANGEN)进行mRNA的反转录,主要过程:取2μL10×RTmix、2μLdNTPs混合液(2.5×10-3each)、2μLOligo-dT15或Random(10μmol·L-1)、1μLQuantReverseTranscriptase配制成混合液并混匀后置于冰上,加入50ng~2μg模板RNA,再加RNase-free水至20μL,最后将反应体系于37℃孵育60min。用紫外分光光度计Nanodrop测定反转录得到的cDNA浓度。1.4.3引用的设计和测试应用引物设计软件Primer5.0进行引物设计,设计的引物如表1。并用ABI9700PCR仪对各引物进行检测。1.4.4单次给药对牛奶乳腺癌上皮细胞热休克的影响采用20μL的反应体系:SYBRGreenPCRMasterMix(2×)10μL、上、下游引物各0.5μL、模板cDNA1μL,加灭菌水至总体积20μL。在ABI7500PCR仪上进行RT-qPCR检测,主要反应条件:95℃变性10min;95℃变性15s,56℃退火33s,72℃延伸40s,40个循环(图1)。采用实时PCR定量2-ΔΔCT方法对奶牛乳腺上皮细胞热休克因子HSF-1、热休克蛋白HSP27、70和90基因表达进行相对定量分析;采用核糖体蛋白R9(RPS9)作为看家基因,分析热休克蛋白基因表达的相对变化。试验中进行质量控制,每次试验设阳性对照,阴性对照和空白对照。1.5数据分析试验中各处理组内设置3个重复,每个试验独立重复3次。数据采用SAS9.0软件ANOVA程序进行单因素方差分析。2结果与分析2.1不同培养时间对牛奶乳腺癌皮细胞增殖的影响奶牛乳腺上皮细胞在正常培养温度38℃和高温42℃条件下的生长曲线(图1)显示:在38℃培养时,奶牛乳腺上皮细胞具有正常的增殖速度,生长曲线符合细胞生长规律。在42℃培养时,奶牛乳腺上皮细胞生长停滞,第1天低于对照组,但差异不显著(P>0.05);第2天细胞数量显著低于对照组(P<0.05);培养的第3~7天细胞数量极显著低于对照组(P<0.01);并且,细胞数量随培养时间的增加而减少。结果说明,高温能够抑制奶牛乳腺上皮细胞的正常生长。2.2对不同培养条件对细胞凋亡的检测在二维的分析图上,细胞分为4个亚群:左下象限为活细胞,右下象限为凋亡细胞,左上象限为机械损伤细胞,右上象限为坏死细胞。从细胞凋亡的叠加直方图中,可以更直观地看出细胞群体的凋亡情况,横坐标代表荧光信号的相对值,纵坐标代表相对细胞数。在38℃培养时,细胞状态良好,凋亡细胞仅为细胞总数的2%;并且,从试验结果可以看出38℃培养不同时间点对细胞凋亡情况基本没有影响,如图2所示。图3显示奶牛乳腺上皮细胞在高温42℃条件下培养不同时间的凋亡情况,图3a,b,c和d显示高温处理不同时间点的细胞凋亡数占细胞总数的百分比。与38℃培养相比,乳腺上皮细胞在42℃培养1h(3a)时即可检测到细胞凋亡数量的明显增加,并且随时间的延长而逐渐增加;3h(3b)时细胞凋亡数量达到总体数量的14%,为4个检测时间点的最大值;5h(3c)和8h(3d)细胞表现出对高温的耐受,凋亡数量与3h相比不再明显增加。图4使用叠加直方图比较了对照组38与42℃培养1、3、5、8h的检测结果,更加清楚地显示了细胞群体向凋亡检测阳性偏移的情况。这些结果说明42℃高温培养会诱导奶牛乳腺上皮细胞的凋亡,但随时间的增加细胞对高温会产生耐受,在检测的1、3、5和8h中,细胞凋亡数量百分比达到一定程度后,不再随高温处理时间延长而增加。2.3高温对hsf-1、hsp27、70、90基因表达的影响图5为引物的检测结果,从图中可以看出各引物的条带清新,无非特异性扩增条带和引物二聚体条带,可以用于RT-qPCR检测分析。采用2-ΔΔCT方法分析定量结果,表2显示了奶牛乳腺上皮细胞在高温条件下,HSF-1与HSP27、70、90基因表达相对定量结果。与38℃的对照相比,高温42℃培养时,HSF-1基因及HSP27、70和90基因在转录水平均有极显著增加(P<0.01),分别为对照组的2.71、2.72、7.48、2.69倍。说明高温胁迫会引起奶牛乳腺上皮细胞HSF-1和HSPsmRNA转录水平的上调。3讨论3.1高温对乳状液的影响在本研究中,奶牛乳腺上皮细胞在38℃培养时呈鹅卵石形和多角形,在培养的前3d处于潜伏期,增殖比较缓慢,而在第4~5天处于对数生长期,增殖非常迅速,而在第6~7天进入平台期,整个生长曲线呈“S”形,符合一般细胞的生长规律,与Pantschenko等、Rose等的报道一致。而高温处理组的细胞数量却始终低于对照组,在连续高温处理的第2天,细胞总数就显著低于对照组(P<0.05),第3~7天时细胞总数极显著低于对照组(P<0.01),这说明高温能对乳腺上皮细胞产生极大的损伤反应,这与前人的研究结果是一致的。Sonna等研究发现在热应激条件下,DNA合成、RNA转录及翻译受到抑制,细胞周期性的生长被抑制,蛋白质发生变性、错误聚集甚至降解,细胞骨架的组成成分分遭到破坏,代谢机制改变而减少细胞内的ATP,细胞内的膜通透性改变;钱永华等报道,家蚕BmN细胞在高温条件下生长停止、甚至死亡;Collier等研究指出,高温能促使细胞功能产生许多的异常,包括对蛋白质合成的阻止、蛋白质结构和功能的缺失、新陈代谢的改变、细胞膜流动性的改变,从而减少了细胞的增殖。3.2高温对hsp60细胞凋亡的影响本研究中使用流式细胞仪检测细胞凋亡,其结果显示高温处理明显升高了乳腺上皮细胞凋亡,这与前人的许多报道是一致的。杜娟等报道,高温能引起线粒体的损伤,引起一些促凋亡因子的释放,从而诱导乳腺上皮细胞的凋亡。管英俊等对原代培养的神经细胞的研究表明,一方面高温直接影响其结构而诱导细胞凋亡,另一方面高温使Bcl-2、Bax等基因异常表达而诱导细胞凋亡;Collier等报道高温处理过的乳腺上皮细胞在HSP70恢复到基础表达水平时,其耐热力基本丧失,而参与凋亡通路的一些基因如BAG-3等的表达是显著上调的,说明乳腺上皮细胞高温处理后是一直处于凋亡的过程中;本试验中随时间增加细胞的凋亡数量不再增加的原因推测有两种,一可能是由于随高温培养时间的延长,细胞已死亡,不再被检测到;二可能是因为应激后细胞启动应激活化的蛋白激酶通路(stressactivatedproteinkinase,SAPK),引起一系列生物学效应,其中包括热休克蛋白的表达增加,从而产生高温耐受。郭亮等报道,乳腺上皮细胞最大凋亡率出现在高温处理后的第6小时,并且证明与细胞热耐受性关系密切的HSP70蛋白在此时集中表达;但对于乳腺上皮细胞产生高温耐受的具体原因和机理还需做进一步的研究。3.3热应激对hsp60基因转录的影响在本研究中,奶牛乳腺上皮细胞42℃高温培养12h后,热休克转录因子HSF-1及HSP27、70和90mRNA转录水平均极显著上调(P<0.01),这与许多研究结果是一致的。早期研究证明了高温能诱导牛血白细胞热休克蛋白表达增加;Edwards等证明了适度的高温胁迫(41℃)能引起早期胚胎中的热休克蛋白的合成增加,而减少其他蛋白质的合成,并引起线粒体肿胀。热应激状态下细胞内的蛋白质产生变性或异常,使其丧失了原有的功能,此时,HSF被激活并形成三聚体进入细胞核,然后迅速激活HSP70基因的启动子,并大量转录HSP70mRNA,导致HSP70mRNA转录水平升高;Collier等发现乳腺上皮细胞HSP70在高温处理的1、2h显著表达,而在4h时达到最高峰。而HSP27家族主要参与微丝的稳定和细胞因子信号转导等作用,在发生热应激时同样发生向核和核仁的移位,表达上调;Samali等的研究发现,U937和Wehi-S细胞在热休克处理时可以引起HSP27和70蛋白的表达,并且证明HSP27和70可以增强这2种细胞对凋亡的抵抗力。Beere等和Didelot等研究证明,细胞表面的Fas/Apo-1受体和它们的配体相结合是诱导凋亡的重要原因,HSP70的表达可以提供一种能够包裹自身和外来抗原的新的免疫物质,从而使细胞避免凋亡。本试