新疆花蚕豆根腐病菌的分离、培养和致病性研究

新疆花蚕豆根腐病菌的分离、培养和致病性研究

甘薯是一种广泛分布于世界各地的蔬菜和豆类。它主要分布在黄淮地区和黑龙江恢复区。随着人民生活水平的提高,对包括花芸豆在内的豆类食品种类和数量的需求越来越多。然而,多种病害时常危害花芸豆的种植,其中根腐病是花芸豆的重要病害之一,一般可减产10%~20%,重病地可减产40%,甚至绝收。因此,查明花芸豆根腐病病原,掌握其发病规律并制定相应的防治措施,对于花芸豆种植业健康发展无疑具有重要意义。近年来,花芸豆在新疆的种植面积不断扩大,同时根腐病的发病率也不断上升。虽然,已经从病原、病原的生物学特性及药剂处理多角度尝试进行了花芸豆根腐病的初步研究,但新疆相关花芸豆根腐病的研究还极少。因此,本研究旨在探索不同条件下花芸豆根腐病的发病规律,为花芸豆根腐病的防治提供科学依据。1材料和方法1.1材料表面供试品种为黑河2号,由阿勒泰地区布尔津县布尔津乡种子公司提供。病土、病株采集于布尔津花芸豆连作5年以上的发病田。1.2样品的制备1.2.1培养基pda将采集回来的病株、病土和带菌种子分别接入普通培养基[马铃薯葡萄糖(PDA)]和专选择性培养基(察氏、胡萝卜、没食子、燕麦琼脂培养基)上。在25~27℃下培养,待长出孢子后进行单孢分离、纯化培养,将长满菌丝的培养基风干后粉碎、封装;同时制备空白培养基一份。1.2.2细菌滤液的制备取病原菌-培养基及空白-培养基各20g,加入1000mL无菌水,在恒温条件下浸提42h,过滤后得到病原原液和空白培养基原液。1.3花制定苗的培养方法土壤进行高温灭菌,种子、花盆严格消毒,花盆直径150mm,每盆播种10粒,置于25~27℃下恒温培育幼苗,2d浇1次蒸馏水。病原滤液浓度在10×10倍显微镜下,每视野8~10个孢子,于花芸豆播种的当天、第6d和第10d各接1次,每盆20mL,重复3次,以空白培养基为对照。第20d用水将盆土充分浸泡,将土坨轻轻倒出,用流水慢慢冲洗附泥,检测根部发病情况。1.4室内生物学特性试验1.4.1预处理4.5温度试验:温度梯度为5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,光照时间0h,通气条件为棉塞封口;pH值为7。光长试验:光照时间为8h,12h,16h,温度为20℃,通气条件为棉塞封口,pH7。通气条件试验:通气条件为胶塞封口、棉塞封口、纱布封口,光照时间0h,pH7。酸碱度试验:pH值梯度为3,4,5,6,7,8,光照时间0h,温度为20℃,通气条件为棉塞封口。将浸有病原滤液的滤纸圆饼(直径6mm)接入PDA培养基上,蒸馏水为对照,重复3次。分别于48h,72h,96h测量菌落生长半径。1.4.2试验条件及试验结果温度梯度为10℃,15℃,20℃,25℃;土壤含水量梯度为4%,8%,12%,16%,20%;pH梯度为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0;容重梯度为1.0,1.1,1.2,1.3,1.5。试验除温度试验外均在15℃恒温下进行,光照条件均为12h,花盆为150mm,每盆病土重500g,播种10粒,3次重复。2d补蒸馏水1次,第20d洗根,检测发病情况。1.5内部防御试验1.5.1d/l模型材料的制备选取7种杀菌剂:50%多菌灵、70%甲基托布津、50%福美双、70%甲霜灵锰锌、50%拌种双、50%五氯硝基苯、50%甲基立枯灵的可湿性粉剂,加入蒸馏水配制成1000,2000,4000mg/kg溶液。每一溶液吸10mL药液均匀平铺于75mmPDA培养基上,无菌水为对照。将制备好的4种病原滤液按1∶1的比例混合,把沾有病原滤液混合液的滤纸圆饼(直径6mm)接入铺有药液的培养基上,每皿3个,重复3次,空白滤液为对照。于24~26℃恒温培养,14d测量病原的生长直径。1.5.2不同温度对盆菌土壤温度的影响见表17种杀菌剂(同上)分别处理种子,药剂量为种子重量的0.2%。每盆菌土500g,播种10粒,清水处理为对照,重复3次。分别置于15℃下恒温培养,2d补灭菌水1次。第18d洗根调查发病情况。1.5.3播深410的强制播种子处理同上,小区面积9m×9m。于4月10日,4月20日2次播种,播深5cm,播量140g/m2,3行为一个处理,各处理随机排列,重复3次。待花芸豆幼苗出土后,调查出苗数,以后结合间、定苗,每10d抽取20株苗调查病情指数。2结果与分析2.1室内病原体的生物学特性测试2.1.1芽孢杆菌属heterwelling、立枯丝核菌f.oxsporum、木刑法经不同培养基分离纯化,共获得4个真菌分离株,根据病原形态和回接植株的发病症状,初步鉴定为:终极腐霉菌(Pythiumultimum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、木贼镰刀菌(F.equseti)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),并分离出孢囊线虫(Heteroderaglycines)。经人工接菌后观察致病情况,于20d后洗根鉴定结果显示,4种病菌对花芸豆均具致病性,孢囊线虫可以制造许多伤口,有利于腐生菌的侵入。2.1.2不同立地条件下木剽刀菌的生长情况引起花芸豆根腐病的4种病原菌对花芸豆幼苗的致病力是有差别的。调查发现,经单一病原接种,以终极腐霉发病最强,其次为立枯丝核菌,木贼镰刀菌的致病力最弱。尤其表现在幼苗的成活率和病情指数上,终极腐霉菌的差异十分明显,存活率低于对照9.00个百分点(表1);病情指数高于木贼镰刀菌24.59个百分点。苗高和侧根数也具有相同的趋势(病情指数分级标准,0级:地下茎和根无病;1级:地下茎和根有零星病斑,但不连片,须根上无病斑;2级:地下茎和根有较多病斑,病斑面积占茎和根总面积的1/4以下,须根略微发病;3级:地下茎和根有多数病斑,病斑面积占茎和根总面积的1/4以上,但不足1/2,幼苗生长受阻,须根减少;4级:地下茎和根病斑面积占茎和根总面积的1/2以上,须根病斑连片,部分须根脱落;5级:地下茎和根布满病斑,须根全部脱落,主根变黑、缢缩)。2.1.3不同通气条件对病原菌生长的影响温度是影响病原菌生长的重要因子之一。在中低温区,不同温度下菌落生长速度的对比试验结果表明,随着温度的升高几种病原菌生长速度均呈现出加快的趋势,但在整个试验温度区间内尖孢镰刀菌生长速度最为缓慢。病原菌起始生长的温度差异显著,5℃低温下只有木贼镰刀菌和终极腐霉菌能缓慢生长;10℃时木贼镰刀菌和终极腐霉菌生长速度较快。光照时间不同病原菌的生长速度反应也不同。木贼镰刀菌和终极腐霉菌对光照时间较敏感,随着光照时间的延长,生长速度逐渐下降;尖孢镰刀菌则不受光照时间变化的影响。封口材料不同造成通气条件的差异,试验结果显示,通气条件对病原菌生长的影响差异不明显,尤其是终极腐霉菌和立枯丝核菌在各种条件下均能迅速生长。随着pH的增加病原菌生长的速度逐渐加快,但pH大于7以后又有减小的趋势。中性偏酸均有利于病原菌的生长。其中,尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌和终极腐霉菌在pH为3时均不生长,立枯丝核菌的pH适应范围较宽,在pH为3和8时仍能生长得很好;尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌和终极腐霉菌对pH均比较敏感,在pH中性偏碱时生长速度明显下降,具体情况见表2。2.2最佳抑菌效果试验结果表明,各种杀菌剂对混合病原致病菌均有不同程度的抑菌作用,并随着药剂浓度的增加抑菌效果逐渐增强。其中,抑菌效果最好的是多菌灵可湿性粉剂,菌群生长几乎完全被抑制,菌落扩展直径最小;其次是甲基立枯灵和福美霜,菌群净生长量也受到了明显的抑制,药剂浓度最高为400mg/kg时,相对抑菌率分别为93.4%和85.0%;抑制效果最差的是甲霜灵锰锌,其药剂浓度为400mg/kg时,相对抑菌率只有62.5%(表3)。2.3家庭游泳池测试2.3.1花制定病趋势根腐病的发生与土壤湿度关系密切,土壤含水量为4%时,种子吸水膨胀困难,发病率较低。土壤含水量为8%时,植株发病明显加重,根部表皮伤口较多。土壤含水量大于16%时,植株发病率有增大趋势。试验结果显示,花芸豆根腐病的发生与土壤含水量关系密切,土壤含水量过大或过小均不利于幼苗生长,植株弱小抗病力差,易受病菌侵染而发病,从而使病情加重。土壤含水量适宜,根腐病发生就较轻。土壤酸碱度与花芸豆根腐病的发生关系非常密切,土壤酸性程度越高越有利于根腐病的发生,中性偏酸有利于植株生长,发病较轻。土壤容重的试验结果显示,随着土壤容重的增加,花芸豆根腐病的发病程度逐渐加重。土壤越疏松越有利于花芸豆幼根生长发育,根腐病发病较轻,土壤过于紧实黏重,根系生长缓慢,不发达,易受到损伤,有利于病菌侵入,植株发病较重(表4)。2.3.2根腐病的防治药剂防效试验结果与室内抑菌试验结果大致相同,但拌种双在低温且水分充足的条件下,对花芸豆根部有轻度药害现象。对根腐病的抑制作用从病情指数上看,防病效果最显著的是多菌灵,较对照低30.8个百分点,其次是甲基托布津和福美双,只有拌种双高于对照2.4个百分点。各处理的出苗率均明显高于对照,以甲基托布津、福美双处理的种子出苗率最高,分别高于对照21.7和16.1个百分点;其次是甲基立枯灵和多菌灵。根长和株高情况均好于对照(表5)。2.3.3保苗、保苗和防效分期播种的花芸豆出苗情况显示,早播田以福美双保苗效果最好,高于对照16.3个百分点,甲基立枯灵最差比对照少0.6个百分点,其余各处理均有不同程度的保苗效果。适播田出苗率普遍高于早播田,保苗效果以福美双最好,高于对照9.7个百分点,其次是五氯硝基苯和多菌灵,也显著好于对照。各处理的保苗幅度略低于早播田,早播对防效影响比较大的是甲基托布津和五氯硝基苯。防效比较稳定的药剂是福美双、五氯硝基苯和多菌灵,在各种条件下均有保持较高程度的防病效果(表6)。病情指数也表现出相似的趋势,值得注意的是甲基立枯灵对花芸豆根系的伸长有不同程度的抑制作用,拌种双的药害现象在田间表现不明显。3不同药剂处理对新疆花东南角的影响通过病原分离、鉴定,初步确定引起新疆花芸豆根腐病的病原主要由终极腐霉菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、孢囊线虫等多种病原菌侵染所致。其中,致病力以终极腐霉菌、立枯丝核菌较强,其他几种病原菌较弱。经过对致病菌生物学特性的测定,发现导致新疆花芸豆根腐病的各种主要病原菌,其生物学特性差异显著。终极腐霉菌和木贼镰刀菌较耐低温,5℃即可生长,尖孢镰刀菌生长发育要求较高温度,15℃生长速度仍较为缓慢。木贼镰刀菌和终极腐霉菌受光照时间影响较大,喜欢黑暗的条件。通气条件对病原菌影响不大,厌氧状态大多数病原菌仍能正常生长。中性偏酸的环境有利于病原菌的生长,立枯丝核菌的适宜生长范围更宽一些。由此来看,早春低温的环境条件下,植株生长发育速度较慢,而终极腐霉菌、木贼镰刀菌和立枯丝核菌等在土壤中却能正常生长、侵染和发病,从而导致新疆花芸豆根腐病常常在