小麦感病抗感病几丁质酶同工酶的研究

小麦感病抗感病几丁质酶同工酶的研究

机会丁酶，也被称为地壳多糖酶，其基质化合物几何质量是大多数真菌红细胞的主要成分之一。1986年Schammbaun等发现几丁质酶对真菌生长有很强的离体抑制作用。Toyoda等人用来源于细菌的几丁质酶处理在大麦表皮细胞中生长的白粉菌吸器,发现几丁质酶能降解白粉菌吸器并抑制菌丝的生长,这表明几丁质酶可能与白粉病抗性有关。但迄今为止,在小麦及其他麦类作物中,几丁质酶在抗白粉病反应过程中究竟扮演何种角色还缺乏深入研究。本文以含Pm21基因的小麦近等基因系为材料,研究白粉菌侵染对小麦几丁质酶同工酶含量的影响,发现了小麦叶片中与白粉菌侵染相关的两种几丁质酶同工酶,并初步探讨Pm21基因在几丁质酶基因表达中所起的作用。1材料和方法1.1抗白领养菌剂试材为小麦抗白粉病近等基因系B1969和扬麦5号。其中B1969是南京农业大学细胞遗传研究所在抗白粉病的小麦?簇毛麦6VS/6AL易位系基础上,以扬麦5号作轮回亲本,回交6代的小麦抗白粉病品系,其染色体臂上携有抗白粉病基因Pm21,对多数白粉菌生理小种表现高抗至免疫。扬麦5号为江苏省栽培品种,易感白粉病。小麦白粉菌菌种由南京农业大学植物保护学院周明国教授提供。1.2方法1.2.1胞间提取液的制备几丁质酶胞内提取液(intracellularextraction,ICE)和胞间提取液(intercellularwashingfluid,IWF)参照Sabine等的方法提取。总提取液(totalenzymeextraction,TEE)参照Boller等的方法提取。蛋白质含量测定参照Bradford等的方法。1.2.2聚偏氟乙烯膜制备5%浓缩胶,12%分离胶,于80V恒压电泳,蛋白质相对分子质量标准品为Amersham公司产品。电泳结束后用BioRad电泳转移装置将分离胶上的蛋白转移到聚偏氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF。Millipore公司产品)上。用封闭液封闭1h,漂洗后将膜浸在一抗溶液(兔抗大麦几丁质酶抗血清,由KSU的S.Muthukrisshnan提供)中过夜,次日取出膜浸在二抗溶液(羊抗兔抗血清,BioRad公司产品)中反应2～3h,用显色试剂显色10min后照相。1.2.3几丁质酶液的浓缩参照Boller等的方法。初步纯化的几丁质酶液在0.01mol·L-1乙酸钠缓冲液中透析3～6h,用PEG浓缩后于-20℃保存。1.2.4室外抗菌试验几丁质酶对白粉菌的降解参照Toyoda等的方法。每毫升小麦几丁质酶液含蛋白50mg。2结果与分析2.1不同接种时间对ch1和ch3的影响对小麦叶片中几丁质酶同工酶进行了Western杂交分析,检测到3种不同相对分子质量的几丁质酶同工酶,分别是CH1(43800)、CH2(27600)和CH3(18400)。其中CH1和CH3的表达在白粉菌诱导后发生了明显变化。从图1可看出,在B1969中,白粉菌接种前CH1的杂交信号较强,随着病程发展,CH1信号呈先降低后恢复的趋势;在白粉菌接种前CH3几乎检测不到,而接种48h后,杂交信号明显增强,随后又降低到原有水平。白粉菌侵染的较早时期,B1969的CH2杂交信号几乎没有变化,只是在侵染晚期含量有一定的增加。几丁质酶含量随叶龄增加略有增长,因此可以认为CH2基本属组成型表达。扬麦5号中CH1的杂交信号随白粉菌侵染时间的延长略有增强,但变化不明显。CH3则随接种时间延长信号逐步增强,至接种11d后,信号增强了数十倍,但其信号增强的速度远比在B1969中慢。扬麦5号中CH2的本底表达较B1969弱,但随着病程发展,信号逐步增强,至接种11d时,信号增强已十分明显。由此可以认为,扬麦5号中的CH2是诱导表达的。2.2胞间质酶基因型别b989为了进一步研究3种几丁质酶同工酶的含量变化及其在细胞中的分布,对B1969和扬麦5号的胞内和胞间几丁质酶同工酶分别进行了Western杂交分析。从图2和图3可看出,CH3主要分布在胞间,CH1主要分布于胞内,CH2在胞内胞间都有分布。在B1969的胞间几丁质酶提取液中,接种48h后CH2、CH3信号明显增强;而在扬麦5号的胞间几丁质酶提取液中,CH2、CH3信号只有在接种96h后才有较明显的增加,说明抗病品系中CH2向胞间分泌的速度和CH3在胞间积累的速度都快于感病品系。CH2和CH3在胞间提取液中的表现与在叶片总提取液中的表现相符。小麦叶片几丁质酶胞间提取液由于样品量较少,未进行蛋白定量,但所有样品均在一致条件下操作,因此对实验结果影响不大。在B1969的胞内提取液中,CH1表现为先降低后恢复的趋势,与总提取液中观察到的现象一致。而扬麦5号胞内提取液的Western杂交图谱可能由于上样及蛋白定量的关系,其表现与总提取液中的Western杂交图谱不完全吻合。2.3soo-n-3细胞中nd-pcr检测ca-射线天气溶酶原激活剂的制备图4所示为亲和层析纯化几丁质酶的蛋白洗脱峰。由于几丁质酶亲和层析酶活峰和蛋白峰基本重叠,因此,可在出现蛋白峰时分别收集pH3.2、pH8.6、pH12.0洗脱液并进行酶活测定。测定结果表明pH3.2洗脱液酶比活最高(数据未发表),将该酶液浓缩后于-20℃保存备用。纯化后酶液中蛋白含量大大降低,纯化倍数约为54.3倍,说明亲和层析可有效地用于小麦几丁质酶的纯化。图3中lane11～14分别为pH3.2、pH8.6、pH12.0的蛋白洗脱液,其中pH3.2的洗脱液分两批收集,lane11样品为总蛋白含量较低的洗脱液(No.1)合并而成,lane12样品为总蛋白含量较高的洗脱液(No.2)合并而成。pH3.2No.1洗脱液中含有2条相对分子质量约为43000和20000的蛋白带,Western杂交结果表明,这两条带是不同的几丁质酶同工酶。其中相对分子质量为43000的条带与CH1相对分子质量相近,可以认为它就是CH1;另一条相对分子质量为20000的条带则介于CH2和CH3之间,在小麦叶片几丁质酶总提取液及胞内胞间提取液Western杂交图谱中都没有其相对的明显杂交信号,目前我们还很难解释这一现象。2.4表皮细胞的酶解用亲和层析纯化的几丁质酶pH3.2No.1洗脱液40μL(酶液中含蛋白50mg·mL-1)处理小麦表皮细胞。4h后发现表皮组织内有明显被酶解的吸器,6h后已有大量吸器被完全酶解或部分酶解。结果证明,由B1969小麦幼苗叶片经亲和层析初步纯化的几丁质酶可以酶解表皮细胞内已经形成的小麦白粉菌吸器。3讨论3.1ch1和ch3在b989中的作用在检测到的3种几丁质酶同工酶中,CH2在抗病品系总叶片提取液中表现为组成型表达,但在感病品系中表现为诱导表达;在胞间,CH2在抗病品系中的积累速度快,而感病品系中CH2积累速度慢。CH3在小麦抗病品系和感病品系中均为诱导表达,且均分布于胞间,但CH3在抗病品系胞间积累的速度明显快于感病品系。可以认为,一方面,CH2较高强度的组成型表达可能对白粉菌的侵染有一定的抵抗作用:另一方面,由于白粉菌往往先在胞间定殖产生菌丝,然后菌丝在胞间伸长并产生压力胞,侵入细胞形成吸器,为真菌生长提供营养,因此CH2和CH3于白粉菌侵染早期在胞间的积累有利于抑制白粉菌的进一步生长。CH1和CH3在B1969中的表现非常有趣,尤其是CH1。CH1在细胞中的含量并非象其他同工酶那样呈先增加后降低的趋势,而是先降低后恢复,根据CH1和CH3含量变化的相关性,推测二者之间可能有某种联系,CH1很可能是CH3的蛋白前体。即在抗病品系中,在受白粉菌侵染时,CH1可作为蛋白前体接受细胞内的基因表达调控,加工剪接后运输到胞间,直接降解白粉菌菌丝或抑制白粉菌的进一步生长。由于CH1在抗病品系中有较高的组成型表达水平,因此能快速对白粉菌侵染作出反应。进一步分析这两种同工酶的氨基酸序列及其功能,将有助于了解几丁质酶在小麦抗白粉菌侵染防卫反应中的作用方式。3.2共感染品对促进ch1和ch3的影响几丁质酶同工酶在B1969和扬麦5号中对白粉菌侵染的不同表现,与B1969所携的Pm21基因有关。前人研究表明,抗病品系与感病品系的主要区别在于前者含有抗病基因,信号传导过程快,防卫反应基因表达迅速,能即时限制真菌生长,因此表现为抗病;感病品系则由于信号传导过程较慢,延缓了防卫基因的表达,使真菌有足够时间在植物中定殖生长,从而导致植物感病。在B1