利用高分子多基元协同效应增强脂质体稳定性的研究

时间：TIME\@"yyyy'年'M'月'd'日'"2022年3月29日学海无涯页码：第1-页共1页利用高分子多基元协同效应增强脂质体稳定性的研究脂质体是磷脂分子通过疏水作用在水溶液中自发形成的球形组装体，其水溶性的内腔和油溶性的磷脂双分子层，为递送不同溶解性的药物分子提供了良好平台.目前，已有多种以脂质体为载体的药物获得FDA批准进入临床，如：Doxil™、ONPATTRO™等[1].研究表明，脂质体的稳定性决定了其在体内循环时间与到达作用靶点的载体数量，从而能够直接影响药物治疗效果.因此，提高脂质体药物载体的稳定性在药物载体的构建中十分重要[2~6].

脂质体的不稳定主要是由于脂质体膜与血清蛋白、表面活性剂等分子相互作用以及双分子层自发的聚集、融合等动态过程所导致的膜融合与破裂[7].研究表明，将线性高分子引入至脂质体表面形成的水化层，可以对脂质体起到良好的稳定效果[8].很多课题组开发了基于电中性高分子聚乙二醇(PEG)修饰脂质体的载药平台，提高了多种载药体系的稳定性[9~12]，降低人体对其清除速率.Ishihara课题组还利用水溶性高分子包被脂质体，延长了内容物包埋在脂质体内部的时间，并通过实验证明通过加入水溶性高分子可提高脂质体在血浆中的稳定性[13].Meland课题组则利用修饰的天然高分子包被脂质体，降低了脂质体保存过程中的内容物外流和脂质体聚集[14].除了电中性高分子，也发展了电荷物质包被脂质体的策略，如Kepczynski课题组通过静电相互作用使富含正电荷的聚丙烯胺盐酸盐衍生物包被含有负电荷磷脂的脂质体膜上，能在血清培养过程中有效阻止血清蛋白进入膜内导致脂质体通透性增强而发生内容物外流[15,16].

在发展直接引入高分子方法的同时，科学家还开发了原位聚合的策略构建高分子包被脂质体，提高其稳定性.其中，位于脂质体亲水表面的原位聚合反应可以在膜表面构建高分子包被.vanHerk课题组利用静电相互作用在阳离子脂质体膜外富集负电荷分子，通过化学交联的方式原位形成高分子聚合物壳层结构，使其整体结构在TritonX-100条件下能够得到保护[17].Fournier课题组利用聚合酶原位催化磷脂表面DNA链增长，在膜上构建DNA交联网络，具有明显的稳定作用[18].同时，科学家们还开发了在磷脂膜疏水区域的原位聚合方法，如：Ringsdorf通过光引发含碳碳三键的磷脂分子在形成脂质体后的膜内发生聚合[19]；Meier通过引发油溶性单体和交联剂在磷脂双分子层内聚合形成高分子壳层[20,21].Aspinwall课题组将乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)通过2,2-二乙氧基苯乙酮(DEAP)的催化作用在磷脂双分子层中原位形成疏水高分子壳层，并可以有效地抵抗表面活性剂导致的脂质体裂解[22]；同样使用EGDMA并将甲基丙烯酸正丁酯(BMA)单体引入至磷脂双分子层内[23]，原位引发聚合形成高分子骨架，在提高脂质体稳定性的同时保证了内容物的生物活性.

近日，受细胞膜“细胞骨架-膜蛋白-脂质双层”原理的启发，本课题组提出并开发了“框架诱导组装(Frame-GuidedAssembly，FGA)”策略[24~27]，在抑制脂质体自发聚集、融合等动态过程方面取得了重要的进展.FGA策略利用各种具有精确控制特性的纳米材料作为框架，通过将分散的疏水分子锚定在框架上，可以构建出不连续的疏水定位基团平面[28]/内[29]/外[30]框架，这将进一步诱导系统中的两亲分子可控组装并形成所预期的二维或三维膜结构.在框架诱导组装过程中，框架中的定位基团表现出了多基元协同效应.在同一框架上且三维分布的定位基团与磷脂双分子层同时相互作用，因此可在长程范围有效抑制膜的波动和变形，从而大幅度提高脂质体的稳定性[31~34]，在与血清共培养中表现出良好的单分散性和膜完整性，并作为高稳定载体实现了在药物递送方面的应用[35].

科学家们在开发脂质体稳定体系和高稳定脂质体制备策略方面已经取得了长足的进步，但为了进一步发展长循环脂质体药物并实现更多的临床应用，继续研发新的脂质体稳定体系依然有很大的必要性.受到框架诱导组装策略的启发，在本工作中，我们合成了接枝了插膜基团的线性高分子，利用高分子链的多基元协同效应[36,37]，通过简便的共混复合策略，制备了具有高稳定性高分子-脂质体复合物.相较于PEG修饰磷脂在脂质体膜外形成水化层从而提高稳定性，插膜高分子的每一个基元之间还存在由高分子主链的共价键连接，通过多基元协同相互作用更大程度上提高了脂质体膜的稳定性.该制备策略过程简单，有效地屏蔽了脂质体表面电荷，抑制了电荷介导的融合和表面活性剂对脂质体结构的破坏，可以延长脂质体在生理环境下保存时间.该复合策略可有效提高脂质体稳定性，在长循环递送药物领域中有广阔的应用前景.

1实验部分

1.1主要材料

1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二(9Z-油酰)-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(DOPS)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(NBD-PE)、N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(LissRhodPE)购于AvantiPolarLipids,Inc.；8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐(ANTS)、1,1-(1,4-亚苯基双(亚甲基))双(1-吡啶鎓)二溴化物(DPX)、去乙酰化壳聚糖购于SigmaAldrich公司；胆固醇、异硫氰酸酯荧光素(FITC)购于希恩思公司；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)-PEG2000-胆固醇购于Nanocs，Inc.；3-(3-(胆酰胺丙基)二甲氨基)丙磺酸内盐(CHAPS)购于Meryer公司；1mol/LTris-HCl缓冲液(pH=7.4)、磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)、D-山梨糖醇购于TCI公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购于百灵威公司；ZebaSpinDesaltingColumn7kMWCO和10kMWCO透析袋购于ThermoFisher公司；盐酸阿霉素(DOX)购于源叶生物公司.

1.2脂质体的制备

1.2.1小型脂质体制备

用传统的薄膜水化方法制备小型脂质体.将磷脂按照配比溶解在氯仿中，加入圆底烧瓶后，通过旋转蒸发仪(200r/min，20kPa，25℃)除去有机溶剂，然后真空干燥至少2h，以形成干燥的脂质薄膜，随后用缓冲溶液(100mmol/LTris-HCl，pH=7.4或PBS，pH=7.4)水化.利用囊泡挤出器(AvantiPolarLipids,Inc.)使溶液反复通过100nm聚碳酸酯膜50次来制备大小合适的脂质体.脂质体溶液放于4℃保存.

1.2.2巨型脂质体制备

巨型脂质体(GUVs)由Nanion囊泡制备机制备.将质量比为45:20:20:15的DOPC、DOPE、DOPS和胆固醇的混合物溶解在氯仿(10mmol/L,1mL)中.在ITO基板上旋涂混合溶液.干燥后，将280μL1mol/LD-山梨糖醇溶液添加到干燥的脂质膜上.运行基础囊泡制备方案(5Hz，3A，36℃，上升时间=3min，保持时间=120min，关闭时间=5min)，获得GUV溶液并将其储存在圆底96孔板中.GUV可在4℃保存至少3天.

1.3插膜高分子的合成与表征

1.34mg乙二醇壳聚糖和5mgNHS-PEG2000-胆固醇分别溶解在1mLPBS缓冲液(pH=7.4,50mmol/L)中，室温下混合，反应4h.在ddH2O中使用10kMWCO透析袋透析3天并冻干后，可获得终产物[38].通过1H核磁共振(1H-NMR)光谱验证胆固醇接枝效果.为了证明胆固醇接枝聚合物的插膜作用，需合成荧光分子FITC标记的高分子.通过8.1μL1.0mg/mLFITCDMF溶液与1mL1.0mg/mL终产物在常温下过夜反应并透析后制得.对照组在不添加锚定基团NHS-PEG2000-胆固醇的情况下合成.

1.4高分子-脂质体复合物的制备

将1.2节中制得的脂质体与1.3节中制得的插膜高分子混合，使磷脂终浓度为2mg/mL，插膜高分子终浓度为300μg/mL.在室温条件下静置15min，通过胆固醇分子与磷脂分子之间的疏水相互作用，使插膜高分子与脂质体形成高分子-脂质体复合物.

1.5荧光共振能量转移(FRET)实验

NBD-PE/LissRhodPE和ANTS/DPX在FRET实验中作为荧光供体-受体对.脂质体融合或破裂后，供体-受体对之间的距离增加，荧光强度增强.向含有2mLPBS缓冲液的石英比色皿中，加入50µL带正电荷磷脂DOTAP和荧光供体与受体标记的脂质体，搅拌直到获得稳定的基线.然后，将40µL含负电荷磷脂DOPS的脂质体(或40µL含中性电荷磷脂DOPC的脂质体)加至比色皿中，使用CaryEclipse荧光分光光度计(AgilentTechnologies)监测荧光信号变化.含NBD-PE/LissRhodPE的FRET实验中，激发波长设置为466nm，发射波长设置为530nm.含ANTS/DPX的FRET实验中，激发波长设置为360nm，发射波长设置为510nm.狭缝宽度设置均为10nm，信号采集间隔均设置为0.5s.

荧光强度百分比计算FI%=(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)，Fmin均为空白对照组的荧光强度最小值，Fmax在抗表面活性剂实验中为加入1%TritonX-100后10min的荧光强度；在抗融合实验中为加入与DOTAP脂质体等摩尔分数的DOPS脂质体混合10min后的荧光强度.F为实时监测的荧光强度测量值.

1.6脂质体透射电镜表征

脂质体的形貌利用JEOLJEM-1400透射电镜在200kV下进行观察.在观察之前，用7mg/mL乙酸铀溶液对样品进行负染.制样方法：10μL样品在铜网上沉积并静置5min(含有正电荷的磷脂只需静置1min)，吸干后用7mg/mL乙酸铀染液洗5s，吸干后再次用7mg/mL乙酸铀染液染1min，吸干后令剩余水分自然挥发.

1.7脂质体动态光散射表征

在石英样品池中加入20μL样品，利用MalvernInstruments公司的动态光散射(DLS)仪器ZetasizerNano在室温条件下平衡60s后开始测量，散射角为90°.每个样品至少测量15次后取平均值.

1.8脂质体表面电荷表征

在样品池中加入1mL1mol/LNaCl反复冲洗100次活化电极，加入1mL磷脂溶液，利用MalvernInstruments公司的ZetasizerNano仪器，在室温下测定ζ电位.

1.9共聚焦显微镜表征

将60μL样品添加到96孔板中.使用激光共聚焦显微镜，25×水镜，在激发波长为488nm的条件下，FITC标记的高分子将在520~530nm处显示绿色荧光.

2结果与讨论

2.1高分子-脂质体复合物的制备与性质

通过合成路线示意图(图1)中的方法，利用活性酯与氨基的取代反应，将胆固醇修饰到壳聚糖上制备插膜高分子，并通过1H核磁共振(1H-NMR)光谱对产物进行了表征.如电子支持信息图S1，δ=0.85和1.26的特征峰为胆固醇的高场信号，结合δ=3.69的PEG链质子特征峰，可以证明胆固醇分子的成功接枝.通过计算未去乙酰化的壳聚糖甲基特征峰(―CH3，δ=2.07)、去乙酰化的H2(D)特征峰(δ=3.24)和PEGH2-H8特征峰(δ=3.69)的积分面积，根据电子支持信息图S1中公式计算，胆固醇的接枝率为31%.我们发现，在接枝胆固醇后，该高分子仍具有良好的水溶性，可溶于PBS、Tris-HCl等溶液，同时，高分子中的胆固醇可以通过疏水作用插入脂质体膜的磷脂分子层，因此会使插膜高分子可以贴附于脂质体膜表面，为提高脂质体稳定性奠定了结构基础.

Fig.1Synthesisofglycolchitosan-cholesterol(GCC).

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为验证胆固醇接枝壳聚糖高分子的插膜效果，利用Nanion囊泡制备机制备了微米级的巨型脂质体(详见1.2.2节，明场图像见电子支持信息图S2)，通过与插膜高分子共混合的方式使其自发地形成高分子-脂质体复合物(图2(a)).为了便于表征，通过合成路线示意图(图1)所示的方法，利用氨基与异硫氰酸根的加成反应，在插膜高分子中引入FITC荧光基团，并通过激光共聚焦显微镜示踪插膜高分子.研究发现，利用Nanion囊泡制备机制备的巨型脂质体在与插膜高分子孵育15min后，可以观察到绿色荧光富集在巨型脂质体膜上(图2(b))，证明了该高分子具有良好的插膜能力.而当用不含有胆固醇的壳聚糖高分子与脂质体孵育相同时间后，溶液中只能观察到均匀分布的荧光亮点，未出现任何绿色荧光亮环(图2(c))，验证了胆固醇基团是高分子插膜的重要因素.以上研究证明了我们制备的插膜高分子可以通过简单混合的方式，利用胆固醇与膜之间的疏水作用，使其贴附于脂质体表面形成复合物.在研究插膜高分子与巨型脂质体相互作用的同时，为证明复合物在后续生物医学方面应用的可行性，我们也验证了该高分子对于纳米脂质体膜的复合效果.通过将薄膜水化-挤出法获得的纳米级小型脂质体(plainliposome)，与插膜高分子混合后制得高分子-脂质体复合物(GCC-liposome)，由于高分子在脂质体表面的富集，粒径相较于空白对照组的脂质体(98.93nm)有一定的增大(116.22nm，图2(d)).通过透射电镜发现(图2(e)和2(f))，在加入高分子后，脂质体的形貌依然保持着球形的形貌特点，并未出现高分子的聚集及脂质体之间的聚集现象，保持了原有的单分散性，且尺寸均一.在磷脂组成相同、浓度相同的情况下，磷脂分子通过疏水作用形成的磷脂单分子层表面积是固定的.挤出法制备的脂质体磷脂双分子层分为外层和内层，磷脂双分子层厚度为4nm.假设脂质体为正球体，则根据球表面积公式可得，脂质体外表面占总单分子层表面积比例为r2/(r2+(r-4)2).直径为100~400nm的脂质体，带入公式计算可知外表面占比为0.51~0.54，相差不大.所以我们认为脂质体的粒径不会对胆固醇接枝聚合物的插入量造成明显的影响.进一步通过测量ζ电位发现，未经处理的含负电荷磷脂DOPS的脂质体ζ电位为-23.2mV，加入未经修饰的壳聚糖高分子后，ζ电位几乎保持不变为-22.0mV.在加入修饰了插膜基团的壳聚糖高分子后，我们发现ζ电位有了明显的升高，达到-1.78mV.以上实验证明了插膜高分子在小尺寸的脂质体体系中依然可以保持良好的插膜效果，并表现出了较好的电荷屏蔽特性，为提高脂质体稳定及生物应用奠定了良好的基础.

Fig.2Preparationandcharacterizationofpolymer-liposomecomplex.(a)Schematicdiagramofthepreparationofpolymer-liposomecomplex.Plainliposomeisliposomewithoutanymodification,whileGCC-liposomeismembrane-integratedpolymer-liposomecomplex,andGC-liposomeisunmodifiedpolymerandliposomemixture;(b)Laserconfocalscanningmicroscope(LCSM)characterizationoftheintegratedpolymer-liposomecomplex;(c)LCSMcharacterizationoftheunmodifiedpolymerliposomemixture;(d)Dynamiclightscattering(DLS)characterizationofliposome;(e)Transmissionelectronmicroscope(TEM)characterizationofpolymer-liposomecomplex;(f)TEMcharacterizationofunmodifiedliposome.

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2.2插膜高分子对纳米脂质体稳定性的影响

纳米脂质体作为药物载体，其稳定性决定了体内循环时间与到达靶点的载体数量，影响了药物治疗效果，因此脂质体药物载体的稳定性是评判递药体系高效与否的重要标准之一.如前所述，我们制备的插膜高分子与脂质体形成复合物后，利用高分子链的多基元协同效应及其对电荷的屏蔽效果，使该体系具有提高脂质体稳定性的前景.脂质体的稳定性一般表现在抗融合、抗裂解和生理条件下结构完整性，所以我们将从这三方面验证高分子对脂质体稳定性的影响.

2.2.1抗融合作用

脂质体载体在负载药物的过程中，如发生团聚可能会造成血管堵塞，所以脂质体的抗融合是十分重要的.通过2.1节中的ζ电位表征发现，插膜高分子具有良好的屏蔽脂质体表面电荷效果，因此可以有效的对抗离子诱导的脂质体聚集.在带有负电荷磷脂(DOPS)的脂质体溶液中加入终浓度为5mmol/LCaCl2(图3(a))，并连续检测高分子-脂质体复合物和对照组脂质体(不含高分子)的粒径变化和PDI变化.从图3(c)和3(d)中发现，高分子-脂质体复合物的粒径在180min后为(229.39±18.09)nm，PDI平均值为0.15，与初始粒径(207.9±4.44)nm相比几乎保持不变.而未含高分子的脂质体在钙离子的促进下，PDI平均值出现明显的增高，粒径平均值达到(1121.38±444.68)nm，与初始粒径(143.83±1.22)nm相比变化显著.通过图3(e)中所示24和72h的透射电镜表征结果可以清晰地看到，普通脂质体形成了大块的聚集体，而大多数高分子-脂质体复合物依然呈现单分散的形貌特点.此外，观察到普通脂质体在3天的静置过后，生成肉眼可见的白色沉淀，而高分子-脂质体复合物溶液依然保持澄清(图3(b)).以上实验验证了通过加入插膜高分子屏蔽脂质体的表面电荷，使其在受到二价阳离子作用的情况下，具有很强的抗融合作用，脂质体稳定性得到显著提升.

Fig.3Liposomeresistingcalciumion-inducedfusion.(a)Schematicdiagramofcharge-inducedliposomeaggregation,fusionandleakageprocess;(b)MacroscopicpictureafteraddingcalciumionsintoplainliposomeandGCC-liposomein3days;(c)Variationintheliposomeparticlesizeafteraddingcalciumions;(d)VariationinthePDIofliposomeafteraddingcalciumions;(e)(e1)and(e2)areTEMcharacterizationsofplainliposomewithoutanymodification.(e3)and(e4)areTEMresultsofmembrane-integratedpolymer-liposomecomplex.

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我们通过含有异种电荷磷脂的脂质体融合过程，进一步验证插膜高分子对脂质体抗融合作用的影响(图4(a)).分别制备含有正电荷磷脂DOTAP和负电荷磷脂DOPS的2种脂质体(电子支持信息图S3和图S4)，其中在DOTAP脂质体中引入了2种在摩尔分数为0.5%条件下可以产生荧光共振能量转移(FRET)的磷脂分子NBD-PE和LissRhodPE.当加入DOPS脂质体后，由于电荷相互作用，脂质体会发生相互的融合，脂质体膜上NBD-PE与LissRhodPE之间的作用距离增加，荧光共振转移降低，NBD-PE供体荧光强度升高.实验发现，实验组(含有插膜高分子)与对照组(不含插膜高分子)相比，高分子-脂质体复合物在抵抗正负电荷磷脂融合过程中具有一定的稳定效果.如图4(b)所示，当负电荷磷脂DOPS的摩尔分数为7.5%时，对照组荧光强度升高至56.17%，实验组为33.84%；DOPS摩尔分数为3%时，对照组荧光强度升高至42.32%，实验组为22.84%.随着负电荷磷脂DOPS摩尔分数的增加，荧光强度的最终值相应升高.当减少插膜高分子的相对浓度时，荧光强度也相应出现了上升.如图4(c)所示，高分子终浓度为300、150、75μg/mL时，在10min后荧光强度分别为28.98%、41.69%、63.93%.这进一步证明了插膜高分子对于脂质体的稳定起到了决定性的作用.随后我们对正负电荷脂质体的混合样品分别进行了粒径和形貌的表征.如图4(d)和4(e)所示，在2天的培养过程中，发现完全没有任何处理的混合样品粒径显著增加，并在图4(f)所示透射电镜表征中观察到脂质体大面积的聚集.而含有插膜高分子的脂质体混合物表现出稳定的粒径大小，在3天的静置后依然保持着单分散的状态.以上实验再次验证了，高分子-脂质体复合物在外部溶液离子强度升高的条件下，可利用其良好的电荷屏蔽能力，降低脂质体的相互融合与破裂，有效抵抗电荷诱导的脂质体融合过程.

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Fig.4Effectofhetero-chargedphospholipidoncharge-inducedliposomefusion.(a)SchematicdiagramoftheFRETfusionexperimentofliposomecontaininghetero-chargedphospholipid;(b)VariationintheFRETfluorescenceintensityunderdifferentphospholipidcomposition;(c)VariationintheFRETfluorescenceintensityunderdifferentintegratedpolymercontents;(d)Variationintheliposomeparticlesizeaftermixingofhetero-chargedliposome;(e)VariationinthePDIofliposomeaftermixingofhetero-chargedliposome;(f)TEMcharacterizationofmixedhetero-chargedliposome.

2.2.2抗表面活性剂作用

为检测插膜高分子对脂质体破裂释放内容物的影响，通过制备包覆荧光分子ANTS和淬灭剂DPX的脂质体，利用FRET原理监测其释放效果.利用ZebaSpinDesaltingColumn7kMWCO去除脂质体外未包封的荧光分子和淬灭剂后，可得到在脂质体内部ANTS和DPX局部浓度分别12.5和40mmol/L的脂质体溶液.随后，选用CHAPS作为模型裂解剂，研究了高分子链的多基元协同效应对膜的保护作用.从示意图5(a)中可知，脂质体溶液荧光强度的上升，是由于荧光分子和淬灭剂从脂质体内释放，局部浓度降低，FRET效果减弱，导致体系淬灭效率降低，荧光强度增加.含有插膜高分子的脂质体在加入高浓度的表面活性剂后，与未经处理的脂质体相比，荧光强度增高得较为缓慢，表现出了一定的稳定效果.我们认为这是通过高分子链上多位点修饰的疏水基团与磷脂分子之间的疏水作用和高分子多基元之间共价连接的协同效应所导致的.如图5(b)所示，表面活性剂终浓度为4mmol/L时，对照组在10min的搅拌过后，荧光强度升高至完全裂解的43.8%，而实验组为34.6%；当表面活性剂终浓度提升至5mmol/L时，对照组裂解率达到65.4%，实验组为56.4%.低浓度表面活性剂处理后，实验组与对照组差别并不明显.我们认为这是由于胆固醇和壳聚糖主链之间还有一段较长的柔性PEG2000，使主链的结构刚性无法通过胆固醇的疏水作用传递给磷脂膜以达到显著提高膜稳定性的效果，但这也可以为脂质体在受到外界刺激快速响应并释放内容物提供一定的帮助.以上实验验证了脂质体在加入插膜高分子后，可以一定程度上抵抗表面活性剂的裂解作用，对脂质体起到一定的稳定效果.提高稳定性的脂质体依然可以成功释放内容物，为其用作药物载体的应用提供了理论可能.

Fig.5Theleakageexperimentofliposomeagainstsurfactant:(