DNA转化实验报告

DNA转化实验报告2009级生物学基地班李晓芬2011.9.22【摘要】DNA转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。本实验以E.coliDH5Α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC-19质粒共保温,实现转化。由于pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过在培养基中加入氨苄青霉素，利用Amp抗性来筛选转化子。同时，蓝白斑法对能够产生β-半乳糖苷酶的转化子进行筛选，最终成功得到了预期的实验组蓝色菌落、对照组无任何菌落的结果。Inmolecularbiology，transformationisthegeneticalterationofacellresultingfromthedirectuptake,incorporationandexpressionofexogenousgeneticmaterial(exogenousDNA)fromitssurroundingandtakenupthroughthecellmembrane(s).DH5ΑisusedtoselecttherecombinantDNAusingtheactivityofβ-galactosidase(α-complementation)recoveredwithlacZαpeptideofthevectorDNAandlacZM15codedinF'episomeinthisstrain.ThisstraincarriesF'episomeanditisusefulforthepreparationofssDNAaswellasgenelibraryconstructionandsubcloning.【关键词】DNA转化、CaCl2法、大肠杆菌、质粒、氨苄青霉素抗性、蓝白斑筛选一、实验目的掌握CaCl2法将载体(质粒)转化入受体(大肠杆菌)的实验技术。二、实验原理1、转化：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化即是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl、KCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的受体细胞)。本实验中，采用较为简便易行的感受态细胞获得办法CaCl2法，用蓝白斑筛选法筛选转化子。2、载体pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，而宿主菌DH5Α对氨苄青霉素没有抗性。在用pUC-19质粒转化DH5Α后，涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培养，没有被转化的菌不能生长，而被转化了的菌可以正常生长，形成菌落。3、α-互补：pUC-19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段,其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。DH5Α宿主菌染色体上带有LacZ的C端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性,但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来,形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。质粒载体与LacZ基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用就称为α-互补。4、如图一，IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ基因载体DNA）以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。如图二，只有成功进行了载体与受体α-互补之后的细菌，才能产生具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，将乳糖转化为半乳糖和葡萄糖，即使底物X-gal水解变为蓝色；而未能将质粒DNA成功导入的细菌则不能形成β-半乳糖苷酶，实现了蓝白斑筛选。三、实验材料1、试剂⑴药品准备：蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂、NaOH、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷（X-gal）、0.1mol/LCaCl2、氨苄青霉素⑵LB固体培养基（80mL）=0.8g蛋白胨+0.4g酵母粉+0.8gNaCl+1.2g琼脂（1.5%）+80mL蒸馏水，NaOH调pH至7.02、仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、台式离心机、超净工作台、恒温水浴锅3、其他：大肠杆菌DH5Α（受体）、质粒pUC19Vector（载体）四、实验步骤1、制备感受态细胞⑴制作选择平板：按配方配制好LB固体培养基后，高压灭菌并冷却到50°C。加入氨苄青霉素母液（500mg/mL）9.6μL,使其终浓度为60μg/mL,倒两个平板。在超净工作台上，分别在两个平板的培养基表面涂布40μLX-gal和8μLIPTG溶液，室温下放置3～4小时。⑵将培养好的20mL大肠杆菌DH5Α转移到一个无菌离心管中，冰上静止放置10分钟，是培养物冷却到0°C。⑶以4000r/min离心10分钟，回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培养液尽量流尽；以1.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2悬浮沉淀。⑷以2000r／min离心10分钟，回收细胞且使培养液流尽。⑸取1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细胞，将细胞分成200μL一份，装入Eppendorf管中，此时的细胞为感受态细胞。2、细胞转化⑴取2管200μL的感受态细胞，1管中加入2μL的pUC-19DNA，另1管为不加质粒DNA的对照，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30分钟。⑵热激反应：将管放到42℃水浴中1.5分钟，不要摇，然后在冰浴中迅速冷却2分钟。⑶每管加入100μL的LB培养基，37℃水浴中温育45分钟。3、培养⑴从转化管和对照管中各取200μL菌液加在两个含有氨苄青霉素及X－Gal和IPTG的选择平板培养基上，用一无菌涂布棒轻轻将细菌涂在琼脂平板表面，将平板置于室温约1小时，直至液体被吸收。⑵倒置平皿37℃培养17h。⑶第二天上午观察结果，记录现象，并大致估计各皿的菌落数。五、结果与讨论1、实验结果如图三可以看到，实验组中长出蓝色菌落，对照组中无任何菌落生长，与预期结果相同。说明载体pUC-19质粒已成功通过CaCl2法导入受体大肠杆菌DH5Α中，完成了α-互补之后将X-gal水解为蓝色物质；而未进行转化的对照组中，原大肠杆菌对氨苄青霉素没有抗性，在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。由于菌液浓度过大，且接种时涂布不均匀，实验组中得菌落连接成片，难以计数，不能根据公式转化频率=转化子总数质粒2、为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：⑴细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制，密度过高或不足均会影响转化效率。⑵质粒的品质和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％(本实验中为1%)。⑶试剂的品质:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的，最好分装保存于干燥的冷暗处。⑷防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3、由于涂布X-gal和IPTG时，培养基在超净工作台上酒精灯附近放置时间过长，稍有熔化，所以造成破损，对结果观察有一定影响。4、涂布X-gal时要注意速度，时间长可能失活，变性后则不能得到预期的蓝色菌落结果。如图四，X–Gal是β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ基因载体DNA）以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。5、LB固体培养基：LB一般被解释为Luria-Bertani培养基，其发明人为贝尔塔尼(GiuseppeBertani)，这个名字来源于英语的lysogenybroth，速溶菌肉汤。LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础。六、思考题1、对照中如果出现菌落会是哪些原因?如果对照中出现菌落，可能的原因有以下几点：⑴没有在培养基中加入氨苄青霉素，使得具有抗性（已进行转化的实验组）和不具有抗性（为转化的对照组）都能够在LB培养基上生长；⑵接种时已接种过实验组的工具被污染，未彻底灭菌后又接种对照组，具有氨苄青霉素抗性的转化子在对照组培养基上生长，出现菌落；所以为避免这种情况，应在接种时先进行对照组，便不会被污染。2、实验组菌落没有转蓝是什么原因？X-gal