骨骼肌废用状态及再负荷对大鼠肌钙蛋白酶活性和细胞膜通透性的影响

骨骼肌废用状态及再负荷对大鼠肌钙蛋白酶活性和细胞膜通透性的影响

在废弃（不活跃、睡眠不良、航空航天等）状态下大约2周，骨脂肌腱就会有显著的萎缩。萎缩的骨骼肌不仅收缩张力下降、疲劳性增加,在再负荷时还会导致骨骼肌损伤,从而严重影响骨骼肌的再适应能力,威胁航天员的航天飞行安全,增加航天员返回地面时的受伤风险。相关研究表明,废用引起的肌纤维横截面积的减小和收缩蛋白的丢失是肌肉收缩功能下降的主要原因,但骨骼肌收缩蛋白的减少机制以及萎缩骨骼肌再负荷引发的骨骼肌损伤机制远未明了。钙蛋白酶(calpain)是存在于胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白水解酶,参与肌肉生长与分化、细胞周期调控和凋亡等重要生理过程,近年的相关研究还发现钙蛋白酶与废用性肌萎缩的发生有关。肌肉萎缩会引起肌肉运动能力的下降,其中一个重要的因素是蛋白质合成减少和降解能力增强。泛素-蛋白酶体是废用状态下收缩蛋白降解的主要途径,但是,它不能降解完整的肌原纤维,而是首先激活calpain以降解膜骨架蛋白,使肌原纤维从细胞骨架上脱落,从而完成蛋白降解,故可认为calpain是废用状态下骨骼肌蛋白降解的启动子。大鼠后肢去负荷2周后,骨骼肌出现明显萎缩,肌细胞内钙离子水平明显上升,细胞内钙水平的升高会促使calpain转移至细胞膜上并激活,释放出具有活性的催化亚单位,启动并降解细胞骨架蛋白,如desmin、肌钙蛋白等,继而启动泛素-蛋白酶体的蛋白水解途径,造成肌纤维的损伤。有研究表明大鼠在经历14d模拟失重后的再负荷会产生离心样损伤,如骨架蛋白降解、Z线结构破坏、过度扭曲等,但具体机制尚不明了。细胞膜通透性的异常改变是细胞微损伤的标志之一,故本实验以骨骼肌细胞膜通透性与calpian活性为主要指标,探讨废用状态及废用后再负荷对大鼠比目鱼肌的影响及骨骼肌的损伤机制。材料和方法1实验分组与分组健康SD雌性大鼠,7周龄,体重210～230g(西安交通大学医学院实验动物中心提供,陕动字第08-005号),自由饮食饮水。分组前对大鼠进行跑台能力测试,剔除不能适应跑台运动的个体。按体重配对原则将48只合格大鼠随机分为4组,正常对照组(control,CON)、正常运动组(CON+training,CON+T)、吊尾2周组(tail-suspension,TS)和吊尾2周后强迫运动组(TS+T),每组12只,6只用于膜通透性实验,6只用于钙蛋白酶活性测定。吊尾组采用尾部悬吊法建立大鼠后肢骨骼肌废用模型。运动组利用动物跑台强迫大鼠运动,将大鼠置于跑台上,通过电刺激和声刺激驱使大鼠运动,跑台速度设置为16m/min,跑3次,每次10min,间歇5min。2悬吊笼制作大鼠尾部悬吊14d,在干净及干燥的尾部表面喷涂安息酊和松香酊,并吹干,用医用胶布粘贴于大鼠干净尾部的后半部,固定尾部,胶布另一头连接在悬吊笼顶部可360°旋转的转接环上,保持大鼠身体与水平面呈30°,前肢着地自由活动,自由饮食饮水。大鼠单笼饲养,悬吊笼宽30cm,长35cm,高45cm,四壁为有机玻璃。饲养室室温20～25℃,人工控制室内照明,每昼夜均保持12h光照与黑暗的循环交替。3垂直电泳槽和hz65-z动物跑台伊文思蓝(Evansblue,EB)和casein(Sigma);Mini-PROTEAN垂直电泳槽(Bio-Rad);DMI6000B倒置荧光显微镜及拍摄装置、CM1850恒冷冰冻切片机(Leica);UV2550紫外分光光度计(岛津);HZ66-Z动物跑台(北京中西远大有限公司);考马斯亮蓝法试剂盒(南京建成生物研究所)。4测试指标4.1大腿骨横截面积csa和肝体重比的测量在进行后续实验前用电子天平对取出的比目鱼肌称重,图像分析仪测量比目鱼肌切片图像中单根肌纤维的横截面积。4.2比目鱼肌的制备大鼠称重后,用45mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉,然后通过颈静脉插管注射3%EB荧光染液,待EB在大鼠体内循环2h后取大鼠后肢比目鱼肌,称重,然后剪成4mm×4mm×4mm的肌肉小块,置于液氮预冷过的异戊烷内冷冻,然后用OCT包埋剂包埋,放入冷冻切片机内准备切片。将OCT包埋的肌肉样品连续切片,厚度为4μm,选择比较好的切片粘贴到浸泡过多聚赖氨酸的载玻片上,使切片完全展开,然后放在冷丙酮中固定5～10min,中性树胶封片。在倒置荧光显微镜下以绿色激发光观察、拍照,每个样本进行多个视野测量,观察EB在肌肉组织中的分布。4.3calpa1活性的检测用相同方法将大鼠麻醉,取大鼠一侧后肢比目鱼肌,以1g∶40mL的比例加匀浆缓冲液(20mmol/LTris-HCl,5mmol/LEDTA,1mmol/LEGTA,1mmol/LDTT,pH7.4),在冰槽中剪碎,用匀浆器以30000r/min转速制成组织匀浆,得到组织匀浆液,然后低温8000r/min离心15min,取上清存放于1.5mLEP管中,置于-70℃存放备用。考马斯亮蓝法测量各组样品的蛋白浓度。每个样品取80μg蛋白与适量的5×上样缓冲液(150mmol/LTris-HCl,20%glycerol,2mmol/L2-巯基乙醇,0.004%溴芬蓝,pH6.8)混匀。酪蛋白酶谱法分析calpain活性,稍作修改。配制12%含casein的分离胶(Acr∶Bis=37.5∶1,0.2%casein,Tris-HCl375mmol/L,0.04%AP,0.28%TEMED,pH8.8),浓缩胶成分为(Acr∶Bis=37.5∶1,Tris-HCl330mmol/L,0.04%AP,0.28%TEMED,pH6.8),电泳缓冲液为(25mmol/LTrisbase,192mmol/Lglycine,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT,pH8.3)。安装好电泳系统,置于冰浴中,先125V预电泳20min,然后将等体积约80μg蛋白样品进行上样,先80V电泳30min,然后转至125V电泳4.5h,使calpain1和F2分离开。在室温下,将凝胶放在水解缓冲液(25mmol/LTris-HCl,10mmol/LDTT,5mmol/LCaCl2,pH7.3)中漂洗2次,每次15min,然后将凝胶在水解缓冲液中孵育20～24h,同时轻轻摇动。反应结束后,在考马斯亮蓝(R-250)染色液中染色1h,脱色液脱色2h。含有calpain条带的胶由于对酪蛋白的分解作用而染不上色,脱色后为浅色的分解条带。通过紫外凝胶成像系统拍照,用ImageJ软件分析凝胶条带,以“浅染区”的水解条带A值/蛋白上样量反映calpain的水解活性。5各变量间的差异显著性检验数据采用SPSS13.0统计软件进行处理,采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行各组间的差异显著性检验。对于不满足方差齐性的,用ANOVA-DunnettT3,进行各组间差异比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1大鼠比目鱼肌正常组大鼠比目鱼肌,细胞饱满,富有弹性。吊尾组大鼠比目鱼肌,呈长薄片状,结缔组织增多。吊尾组与正常组大鼠相比,比目鱼肌湿重体重比减少了41.5%,肌纤维横截面积也显著减小(P<0.01),见表1。2ts组的细胞充神EB与血液中的血清白蛋白结合物在绿色激发光下显红色,由图1可以看出CON组(图1A)和CON+T组(图1B)的细胞形态饱满、紧密,细胞间隙充有红色荧光,毛细血管周围有明显染色,基本无EB染料进入细胞;TS组(图1C),肌束间隙变大,结缔组织增多,个别细胞充盈EB;TS+T组充盈EB的细胞数量明显增多,有较多细胞出现EB的不完全进入(图1D)。上述结果提示单纯吊尾对肌纤维膜通透性的影响并不显著,而吊尾后的强迫运动使膜通透性明显升高,原本不能通过细胞膜的EB部分透过细胞膜进入细胞。3吊尾前后和多次给药calpa11的活性比较Calpain水解条带显示:单纯吊尾和吊尾后强迫运动组的calpain1和calpain2活性均有不同程度的升高,见图2。对calpain1水解条带的分析结果显示,与正常对照组相比,吊尾组calpain1的水解条带吸光度明显增加(P<0.05),最高可达到正常组的3倍,并有自激发条带产生,表明calpain1活性明显升高;吊尾后强迫运动组的水解条带更加明显(P<0.01),表明废用后再负荷可使calpain1的活性进一步升高。对calpain2水解条带的分析结果显示,与正常组相比,吊尾组calpain2的水解条带吸光度增加,但差异无统计学意义(P>0.05),吊尾后强迫运动组的水解条带吸光度有明显升高(P<0.05),伴有自激发条带的增强,表明废用后再负荷使骨骼肌calpain2的活性显著升高。讨论1吊尾前后大鼠比目鱼肌的重量变化、肌纤维面积和比目鱼肌尺寸的变化大量研究表明,在废用状态下,肌肉萎缩最明显的改变就是肌肉重量减轻。从本实验结果看来,大鼠在经历吊尾后,比目鱼肌的重量明显减小,肌纤维面积也大幅减小,这提示吊尾14d后,大鼠的比目鱼肌发生了明显的萎缩。这也与前人以及本课题组以前的研究报道相一致。2过特质膜损伤检测EB是一种经典的示踪剂,静脉注射EB后,它可以与血清蛋白结合形成EB-白蛋白复合物,可用荧光显微镜在565nm处检测其分布。正常情况下该染料不能透过细胞膜,主要分布于细胞间隙,如果胞内出现EB,表明细胞膜的完整性破坏,出现微损伤,因此,这一荧光染料被广泛用于检测细胞膜的通透性。大鼠后肢骨骼肌在经历14d废用状态之后再负荷,引起了抗重力肌比目鱼肌的损伤,使原本不能透过细胞膜的荧光染料EB可以透过细胞膜进入细胞,说明肌细胞膜的通透性发生了改变,膜的屏障功能受损。显然,细胞膜损伤是废用状态及废用后再负荷导致肌损伤的重要机制之一。这一结果为进一步探讨萎缩骨骼肌的损伤机制提供了新的实验资料。3废用状态对calpa1活性的影响Calpain是一种依赖钙离子的蛋白水解酶,迄今为止,在哺乳动物细胞内已经发现了至少14种calpain家族成员,其中,最主要的是calpain1和calpain2。Calpain1和2在体内都有一个最低钙离子激活浓度,calpain1为微摩尔级,calpain2为毫摩尔级,calpain1比2更易激活。已有研究表明多种因素可降低calpain激活所需的钙离子浓度:(1)与细胞膜结合,有利于降解膜骨架蛋白;(2)内源性抑制剂calpastatin表达的减少;(3)提高Ca2+浓度,使calpain构象变化而表现蛋白水解酶活性;(4)calpain的自激活,自激活后,激活所需的钙离子浓度则大幅降低,其机制尚不清楚。一个可能的原因是自激发后移去了其氨基端一段抑制酶活性的肽链而引起酶分子构象变化。骨骼肌的废用性萎缩,伴随胞内钙离子浓度的异常升高,当肌纤维内钙离子浓度达到一定浓度时,激活calpains,释放出具有活性的催化亚单位,进而降解骨架蛋白。使肌原纤维从细胞骨架上脱落,然后通过泛素-蛋白酶体降解途径降解蛋白质,造成肌损伤。本实验通过酪蛋白酶谱法测定大鼠比目鱼肌calpains的活性发现,废用状态下calpain1、2的活性均高于正常对照组,这与Goll等的研究相一致。有研究表明,大鼠后肢废用后再负荷,肌纤维会发生进一步损伤,这可能是肌纤维进行离心样收缩以及炎症造成的。本实验也证实,在废用状态后再负荷时calpain活性的升高更加明显,这可能与强迫运动造成胞内钙离子浓度进一步升高以及由此诱发的钙蛋白酶对蛋白降解的进行性增强有关。其中calpain对膜骨架蛋白的降解可能是细胞膜完整性受损继而导致细胞膜损伤的原因之一,但是,calpain对其底物的降解是否达到病理程度还需进一步验证,这也是后续实验需要完成的工作。自上世纪90年代起,calpain活性