一种抗ha-cds脱菌-免疫吸附纳米荧光碳点的制备及初步应用

一种抗ha-cds脱菌-免疫吸附纳米荧光碳点的制备及初步应用

建立快速检测方法，快速诊断食物源性疾病的致病性微生物，有助于制定快速处理措施。随着材料科学的快速进展,一类新型纳米荧光标记材料———纳米荧光碳点(carbondots,CDs),因其独特的光学特性,尤其有荧光稳定、生物相容性好等特点,已开始应用于生物医学领域。在对合成的CDs进行前期生物相容性研究的基础上,本研究以乙型副伤寒沙门菌为例,结合抗体耦联磁珠粒的富集作用,初步探讨建立应用CDs技术快速检测样本中病原微生物的免疫学检测方法。1材料和方法1.1实验试剂和菌株1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)购自Sigma公司;BCA蛋白质浓度测定试剂盒(增强型)购自碧云天生物技术研究所;磁珠粒试剂盒购自上海奥润微纳公司。CDs自制,方法参见文献。抗沙门菌O4因子抗体(抗O4)和抗Ha因子抗体(抗Ha)均购自宁波天润公司。非特异性抗体正常兔IgG为本室自制。乙型副伤寒沙门菌株和大肠埃希菌均为江苏大学基础医学与医学技术学院实验中心微生物室保存。免疫亲和分离液用含8mol/L尿素、10g/LSDS、1g/LBSA、pH7.0的PBS。1.2leicacssp5CaryEclipse荧光光谱仪(美国Varian公司);LeicaTCSSP5激光共聚焦显微镜(德国Leica公司);Rainbow酶联免疫分析仪(奥地利Tecan公司);磁分离器(美国Invitrogen公司)。1.3抗o4抗体耦合取磁珠粒(10mg/mL)200μL于1.5mL的Eppendorf管中,加入终浓度4g/L的抗O4抗体,在pH7.2条件下用碳二亚胺法将抗O4抗体耦联到磁珠粒上,在磁分离器上将未结合的抗体洗去后,用PBST液(pH7.4,0.01mol/L,含10g/LBSA、0.05%吐温和0.2g/LNaN3)重悬磁珠粒,即获得抗体耦联磁珠粒。1.4标准曲线的制备用pH7.4、0.2mol/L的PBS将0.5g/LBSA稀释成0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L8个浓度,按1.3方法耦联磁珠粒,用酶联仪检测吸光度(A),制备标准曲线,以此标准曲线对实验中标记用的抗体进行定量。磁珠粒耦联抗体的效率按以下公式计算。耦联效率=[(耦联用抗体量-耦联后上清液抗体量)/耦联用抗体浓度]×100%。1.5抗o4-磁珠粒富集细菌的能力取1滴制备好的抗O4-磁珠粒加在载玻片上,加入适量乙型副伤寒沙门菌,混匀,待充分反应后,洗去游离的细菌,将抗O4-磁珠粒晾干后,革兰染色,借助激光共聚焦显微镜观察抗O4-磁珠粒富集细菌的能力。用非特异性抗体耦联的磁珠作对照。1.6sds的组成和性能1.7抗ha抗体制备用碳二亚胺法将抗Ha抗体耦联到CDs上。具体方法如下:取1mg/mL羧基化的CDs溶液200μL,加入PBS(pH7.2,0.01mol/L)400μL,再加入EDC20mg,溶解,混匀,涡旋5min后,再室温静置15min。然后,加入NHS5mg,溶解,混匀,涡旋15min,再加入终浓度8g/L抗Ha抗体,混匀,室温涡旋1h。将上述溶液12000r/min、4℃离心20min,移除上清液(上清液可以用于耦联效率的计算),加入PBS100μL,洗涤2次,再加入PBS100μL,彻底混匀,即为抗Ha抗体耦联CDs(抗Ha-CDs)。1.8抗cds耦合抗体的亲和力检测1.9颗粒凝集试验取1滴抗Ha-CDs加在载玻片上,与适量乙型副伤寒沙门菌混匀,静置数分钟后观察结果。出现颗粒凝集现象为阳性反应。用非特异性抗体耦联的CDs作阴性对照。1.10菌液浓度pbs将乙型副伤寒沙门菌接种在普通营养肉汤中,37℃培养15~18h,然后用无菌PBS(0.01mol/L,pH7.2)作10倍系列稀释,得到不同浓度的菌液。取该菌液涂布于普通琼脂平板上,37℃培养48h,计数生长菌落,得到菌液浓度(CFU/mL)。大肠埃希菌的菌液制备同此。1.11磁分离和测定cds取抗O4-磁珠粒480μL,加入到12mL含不同浓度细菌(101~107CFU/mL)的样本液中,室温涡旋混匀30min,将样本置磁分离器上静置5min,去除上清液,加入PBS(pH7.4,0.01mol/L)重复分离3次后,用PBS重悬磁珠。加入抗Ha-CDs480μL,室温涡旋混匀30min,同上法再进行磁分离,重复3次。加免疫亲和分离液2.4mL重悬并解离CDs,磁分离器上分离磁珠粒后,用荧光光谱仪测定激发波长408nm时免疫亲和分离液中CDs的荧光强度。用生理盐水作空白对照,用大肠埃希菌作阴性对照。以空白对照管进行仪器调零,检测各管的荧光强度。2实验和结果2.1抗o4抗体浓度的确定将磁珠粒在不同pH值(6.0~8.0)条件下,与抗O4抗体耦联,确定最适耦联pH为pH7.2。在pH7.2条件下,取磁珠粒与不同蛋白质浓度(2、4、6、8、10g/L)的抗O4抗体耦联,确定最适耦联抗体浓度为4g/L。在此基础上,再观察不同耦联时间(30、60、90、120、150和180min)对耦联效率的影响,确定最适耦联时间为120min。根据方法1.4中公式,计算出抗O4抗体耦联磁珠粒的效率为45.0%。2.2抗o4-磁珠粒与乙型副伤寒沙门菌的可能配合结果显示:耦联抗O4抗体的磁珠粒可结合乙型副伤寒沙门菌(图1B中红色的是乙型副伤寒沙门菌),而非特异性抗体耦联的磁珠粒不能结合该细菌(图1A),表明抗O4-磁珠粒可特异性结合乙型副伤寒沙门菌。2.3抗ha抗体环境质量的模拟本实验中所用CDs直径3~5nm,较均匀、无团聚现象,激发波长为408nm,发射波长为487nm,表面含羧基(-COOH)。参照2.1方法进行耦联条件的优化,结果表明抗Ha抗体耦联CDs的最适pH为7.2,最适抗体浓度为8g/L,最佳时间为1h。在此条件下,抗Ha抗体耦联CDs的耦联效率为38.0%。2.4压缩波长的选择抗Ha因子-CDs的荧光发光特性检测结果显示,CDs在耦联抗体后。其发射波长由耦联前的488nm变为耦联后的490nm。玻片凝集反应结果表明,抗Ha-CDs能与乙型副伤寒沙门菌发生凝集,而非特异性抗体耦联的CDs与乙型副伤寒沙门菌不发生凝集。2.5菌液浓度对荧光强度的影响结果显示,当样本中菌量达到103CFU/mL,随着菌液浓度的增加,荧光强度也随之增加。而大肠埃希菌对照则无此量变的效应,即CDs荧光信号无变化,见图3。3cds的荧光检测近年来,新型纳米荧光材料不断被开发,并用于生物标记。其中,量子点(quantumdots,QDs)因荧光稳定性强、抗光漂白、激发光谱宽、发射光谱窄等特点,得到生物医药界较多关注,并用于生物活体标记和检测应用中。但有研究发现,目前研究最多的CdSeQDs和CdTeQDs因含重金属离子,在生物体内或标记过程中呈现出一定的生物毒性。而本文利用的另一纳米级荧光材料CDs有着与QDs类似的荧光特性,但合成方法更简单。我们前期的研究结果显示,CDs在体外对细菌的细胞毒性较弱。为此,本文利用CDs耦联特异抗体建立了快速检测样本中乙型副伤寒沙门菌方法。结果显示,其检测灵敏度可达103CFU/mL,并可在2h内完成。实验中CDs的荧光信号可用便携式光谱仪进行检测,因而可满足现场检测的需要。另外,尽管本实验中检测的是乙型副伤寒沙门菌,但若在体系中改变耦联用特异性抗体,可使该方法适于检测目前大多数病原