第三章细胞生物学的研究方法

细胞生物学

研究方法学习要求熟练掌握观察细胞形态结构的基本方法；熟练掌握进行细胞组分分析的一些基本方法；熟练掌握细胞培养、细胞工程与显微操作技术。CompanyLogo第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。CompanyLogo一、光学显微技术（一）普通光学显微镜技术

1、构成：照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时附加滤光片控制光的波长。光学放大系统：目镜和物镜组成。机械装置

CompanyLogo目镜物镜转换器物镜载物台镜座载物台转动杆镜臂电源开关光强调节钮聚光器粗/微调螺旋视场光阑CompanyLogo2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。CompanyLogo3、分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A为镜口率（数值孔径）＝Nsinα/2。N=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：如何提高显微镜的分辨能力？CompanyLogo介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66几种介质的折射率CompanyLogo显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好（1.7）。α最大值可达1400，空气中N=1，最短的可见光波长λ为450nm，此时D=292nm，约0.3μm。在油镜下，N可提高到1.5，此时D可达0.2μm。普通光线的波长为400-700nm，分辨力数值约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。CompanyLogo在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。CompanyLogo石蜡切片的一般步骤：1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。2．固定中性福尔马林固定液，固定10小时以上。3.洗涤材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。4.脱水材料依次经50%、70%、80%、90%、95%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入100%2次，每次20min。CompanyLogo5．透明材料依次经1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液30-45min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。6．透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟(在60℃恒温箱中进行)。7.包埋CompanyLogo8.切片9.展片、贴片10．染色CompanyLogo

把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。可用于观察活细胞。1、相差显微镜

由泽尔尼克（P．Zernike）于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。（二）相差和微分干涉显微技术CompanyLogo

在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑：使照明光线从环状的透明区进入聚光器，再斜射到标本上。相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。相位板环状光阑CompanyLogo用途：观察未经染色的玻片标本

相差显微镜下的细胞有丝分裂CompanyLogo相差显微镜下的线虫

相差显微镜下的细菌芽孢2、微分干涉显微镜干涉：两列频率相同的光波在空中相遇时发生叠加，在某些区域总加强，在另外一些区域总减弱，出现明暗相间的条纹或者是彩色条纹的现象叫做光的干涉。CompanyLogo1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉显微镜（differentialinterferencecontrastmicroscope），是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。CompanyLogo微分干涉显微镜下的硅藻（伪彩色）

微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如核、线粒体等。如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。CompanyLogo特点：光源为紫外线，波长较短分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片。光源前的用以滤除可见光；目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。照明方式通常为落射式。即光源通过物镜投射于样品上。（三）荧光显微镜技术CompanyLogoCompanyLogo用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreenCompanyLogo（四）激光扫描共聚焦显微境技术

激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。CompanyLogo特点：

用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。CompanyLogoLCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)CompanyLogo(五)荧光共振能量转移技术

在生命科学领域，荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。CompanyLogo

供体蛋白CFP的发射光谱与受体蛋白YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。CompanyLogo当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色利用FRET检测细胞内钙浓度变化，将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内CompanyLogo应用:

检测酶活性变化关于膜蛋白的研究细胞膜受体之间相互作用细胞内分子之间相互作用CompanyLogo光漂白后荧光恢复技术（fluorescencerecoveryafterphotobleaching，FRAP）是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率。(六)荧光漂白恢复技术CompanyLogo

FRAP技术的原理利用高能激光照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子不可逆的淬灭，这一区域称荧光漂白（photobleaching）区。随后，由于细胞质中的脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区荧光分子不断向光漂白区迁移。结果使荧光漂白区的荧光强度逐渐地回复到原有水平。CompanyLogo应用：测量2-维或3-维分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。

CompanyLogo二、电子显微镜细胞中直径小于0.2um的结构统称为超微结构（submicroscopicstructure）。超微结构需用电子显微镜（electronmicroscope）进行观察。电子显微镜分辨率一般为0.2nm，最高达0.08nm。CompanyLogo1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别（一）电子显微镜的基本知识CompanyLogo电子显微镜与光学显微镜的根本区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差CompanyLogo２、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数

分辨本领：是指电镜处于最佳状态下的分辨率电镜分辨率受制样技术的影响。３、电子显微镜的基本构造电子束照明系统：电子枪、聚光镜。成像系统：物镜、中间镜和投影镜等。真空系统：保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空，以利于电子的运动。记录系统CompanyLogo（二）主要电镜制样技术介绍1、超薄切片技术取材：必须要做到快、小、准、冷等四大要点。固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品。脱水：乙醇或丙酮梯度脱水，50％→70％→80％→90％→95％(每次5-15min)→100％(2-3次，每次15min)→100％环氧丙烷。包埋：环氧树脂包埋。切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片。染色：重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象。CompanyLogo用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。2、负染技术负染色的肌动蛋白CompanyLogo3、冰冻蚀刻

freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复（replica）。CompanyLogo４、电镜三维重构技术

对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理后而展现的电子密度图。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。CompanyLogo透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope，TEM）是利用高能电子束充当照明光源而进行放大成像的大型显微分析设备。1933年，德国科学家卢斯卡（Ruska）和克诺尔（Knoll）研制出了世界上第一台透射电镜，并在1939年由西门子公司以这台电镜为样机，量产了第一批商品透射电镜，约40台，分辨能力比光学显微镜提高了20倍。

5、透射电镜技术CompanyLogo总体设计与光镜相似，但要大得多，且上下颠倒。电镜用电子流（电子枪发射的高速电子束）代替照明的光线；用特殊的电极或磁极（静电透镜和磁透镜）代替聚光镜、目镜和物镜的作用，达到聚焦和放大的作用。CompanyLogo

工作原理当电子束透射样品时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余电子成像，经物镜和投射镜等放大后投射到照相底片上或荧光屏上。散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区，相反，标本密度小的部位散射的电子少而形成明区。由于透射电镜的电子穿透力较弱，所以观察样品需特殊制备成超薄切片（其厚度一般为50-100nm）。CompanyLogo特点：以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50-120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（小于0.2um）。CompanyLogoCompanyLogo扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。它能产生样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维。分辨力为6-10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。6、扫描电镜技术CompanyLogoCompanyLogo

通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像，二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关，即与样品的表面结构有关。经标本表面所发射的二次电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。CompanyLogo为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CompanyLogoCompanyLogo人类精子红细胞CompanyLogo三、扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）是一种利用量子理论中的隧道效应探测物质表面结构的仪器。它于1981年由格尔德·宾宁及海因里希·罗雷尔在IBM位于瑞士苏黎世的苏黎世实验室发明，两位发明者因此与恩斯特·鲁斯卡分享了1986年诺贝尔物理学奖。CompanyLogo原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1-0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。CompanyLogo搬动48个Fe原子到Cu表面上构成的量子围栏一氧化碳分子竖立在铂表面上形成的“分子人”硅表面7×7重构图硅表面硅原子的排列硅表面硅原子的排列7个铀原子团CompanyLogo原子力显微镜原子力显微镜（AtomicForceMicroscope，AFM）是继扫描隧道显微镜之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器。1986年第一台原子力显微镜问世。CompanyLogo原理：是一种利用原子、分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针,被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针很靠近样品时，其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像，就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。应用:可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测，或者直接进行纳米操纵。CompanyLogo

局部蝴蝶翅膀鳞片

红血细胞形貌图多孔氧化铝范本第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机。转速>25000r/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。

CompanyLogo1、差速离心技术：定义：差速离心（differentialcentrifugation）是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

CompanyLogo2、密度梯度离心定义：密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）是用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：有足够大的溶解度；不与分离组分反应；而且不会引起分离组分的凝集、变性或失活。CompanyLogo原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法CompanyLogo蛋白质定性：氨基酸或肽与茚三酮反应生成蓝紫色化合物；蛋白质与米伦试剂反应形成红色沉淀（酪氨酸特有）；氢氧化重氮与蛋白质反应形成有色复合物。金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。CompanyLogoDNA定性：Feulgen反应（醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色）。多糖定性：PAS反应即过碘酸希夫反应（过碘酸可氧化多糖使其暴露出醛基，醛基与品红反应）。脂肪定性：四氧化锇与不饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的存在；苏丹Ⅲ使脂滴呈深红。CompanyLogo三、特异蛋白抗原的定位与定性(一)免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术称为免疫荧光素技术（immunofluorescence

）。常用的标记物有荧光素和酶。常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。CompanyLogo(二)免疫电镜技术

又称为免疫细胞化学技术是在免疫组织化学技术的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。

CompanyLogo铁蛋白标记技术

适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。

CompanyLogo酶标记免疫电镜技术将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定