菜蛾盘绒茧蜂卵表面超微结构观察

菜蛾盘绒茧蜂卵表面超微结构观察

寄生虫在主体内的成功发育主要是因为寄生虫受到保护，而忽视了主体内的红细胞囊（vinson，1990）。寄生蜂与寄主昆虫之间的免疫反应和免疫抑制是一个复杂的防御与反防御的斗争过程。迄今为止,在多个寄生蜂-寄主昆虫体系中,对寄生蜂如何克服寄主免疫系统的攻击进行了研究。但是,只有为数极少的体系中,寄生蜂所拥有的免疫抑制因子被系统的研究过。如中红侧沟茧蜂-黏虫MicroplitismediaterHaliday-PseudaletiaseparataWalker体系中揭示了类病毒样纤丝(virus-likefilaments,VLFs)、多分DNA病毒(polydnavirus,PDV)、毒液和畸形细胞等的特性及其在免疫抑制方面发挥的作用(Tanaka,1987;StrandandDover,1991;StrandandWong,1991;秦启联等,2001)。黑头折脉茧蜂-烟芽夜蛾Cardichilesnigriceps-Heliothisvirescens体系中,蜂卵表面的纤维层使其被动逃避寄主血细胞的包囊,而PDV基因表达则有破坏寄主烟芽夜蛾血细胞的功能(DaviesandVinson,1986;Varricchioetal.,1999)。索诺齿唇姬蜂-烟芽夜蛾Campoletissonorensis-H.virescens体系中,姬蜂在寄生初期通过蜂卵表面携带的卵巢蛋白发挥快速、短暂的免疫抑制作用,直至24h后PDV基因表达产物破坏寄主血细胞形态,以此建立长久的免疫抑制机制(WebbandLuckhart,1996)。除上述提及的体系外,尚缺乏对寄生体系可能涉及的免疫抑制因子进行全面而系统的揭示。而且,从以上研究结果也不难发现,不同寄生体系中涉及的免疫抑制因子的种类和功能存在着一定的差异。我们认为对于一个寄生体系,只有在全面探明寄生蜂可能拥有的免疫抑制因子的种类和特性的基础上,才可能正确评价各因子在寄生蜂发育的不同时期所发挥的作用,从而避免片面夸大或忽视某个因子的作用。而且,有些寄生因子还与寄生蜂的寄生能力有关(Barrattetal.,2006),直接影响寄生蜂的生物防治效果。鉴于此,在研究菜蛾盘绒茧蜂Cotesiavestalis(Haliday)的幼期发育和菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesiavestalisbracovirus,CvBV)及其部分基因、畸形细胞、毒液和卵巢蛋白等特性的基础上(白素芬等,2002,2003;Chenetal.,2007,2008;Huangetal.,2007,2008;Yuetal.,2007,2008;刘鹏程等,2008;Shietal.,2008a,2008b,2008c),本文以菜蛾盘绒茧蜂-小菜蛾C.vestalis(Haliday)-P.xylostella(L.)为寄生体系,重点对产卵寄生时蜂卵携带的寄生因子特性进行观察,分析CvBV抑制寄主免疫反应的能力,并对所涉及的寄生因子的免疫抑制能力进行讨论。寄生蜂免疫抑制因子的系统揭示,将有助于全面理解寄生蜂成功战胜寄主免疫攻击的能力,深刻认识寄生蜂与寄主昆虫的协同进化关系,并对寄生蜂的合理利用发挥指导作用。1材料和方法1.1不同光照、光照对小菜螟幼虫续代饲养的影响菜蛾盘绒茧蜂在(25±1)℃,RH60%～80%,光照周期14L∶10D,光照强度1000～1500lx的人工气候室内用2～3龄小菜蛾幼虫续代饲养。羽化后的成蜂用10%的蜂蜜在保蜂盒内饲养。1.2小菜红树虫的放养将交配过的菜蛾盘绒茧蜂雌蜂1头移入指形管(8cm×1.5cm)中,接入3龄小菜蛾幼虫1头,一次寄生行为发生后,换以未接触过蜂的同龄小菜蛾幼虫,控制每蜂寄生5～8头。将寄生后的小菜蛾幼虫接入插有嫩甘蓝叶片的小养虫笼内在上述条件的培养箱内进行饲养。每笼接虫30～40头,重复3次。1.36吸引小菜红蜂的出现按照白素芬等(2003)的方法,用剂量100Gy的60Co照射交配过的雌蜂。随后按上述方法让其寄生3龄小菜蛾幼虫,以此获得被假寄生小菜蛾,共计500头。与未经辐射处理的正常雌蜂寄生的同龄小菜蛾幼虫发育做比较,同时均以未被寄生的小菜蛾幼虫发育做对照。正常寄生和未被寄生小菜蛾各60头。1.4离子束诱变卵的获得在Ringer’s生理盐水中将雌蜂整个生殖系统取出,分别将卵巢管和输卵管萼区的卵或单个卵巢分离;解剖被正常寄生的小菜蛾幼虫,从中获得产后2,33和35h蜂卵。固定后制备样品,除对2h蜂卵按扫描电镜样品方法制备外,其余均以透射电镜样品制备,用作电镜观察。1.5电子显微镜观察1.5.1扫描电镜观察将收集的蜂卵以2.5%戊二醛固定,于4℃冰箱中过夜。经0.1mol/LPBS冲洗后,以4%锇酸后固定,接下来用系列乙醇梯度脱水,临界点干燥、喷金,扫描电镜观察(PhilipsXL30ESEM)。1.5.2透射电镜观察将来源于卵巢不同部位的蜂卵、被寄生后0.5和2h小菜蛾幼虫和解剖获得的2,33和35h蜂卵分别用2.5%戊二醛前固定4h,0.1mol/L的PBS冲洗,4%锇酸后固定2h,乙醇梯度脱水,Epon812包埋,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,透射电镜观察(JEM-1200EX)。1.6蜂卵数量的观察假寄生后,36h内每隔2h定时解剖小菜蛾10头。随后,每日定时解剖20头小菜蛾中蜂卵,连续8d。在相差显微镜(LEICADMLMPS30)下,观察蜂卵的包囊或血细胞黏附以及黑化情况并进行拍照,统计各类蜂卵数量。在随后的寄生时间内继续观察蜂卵是否被包囊直至假寄生后第17d(此时多数被假寄生小菜蛾幼虫开始死亡)。2结果与分析2.1盘绒卵蜂卵的分离和发育从卵巢管、输卵管萼和被正常寄生小菜蛾体内分别获得3种不同发育状态的蜂卵。卵巢管中的卵尚未发育成熟,卵表面有滤泡细胞覆盖,可以看到细胞下面的纤维层分布在卵壳表面,其厚度约为133nm(图1:a)。从输卵管萼中获得的蜂卵,其卵表面有规则、整齐的纤维层覆盖(图1:b)。寄生后2h,产在寄主小菜蛾体内的菜蛾盘绒茧蜂卵表面纤维层依然清晰可见,其厚度约120nm(图1:c)。随蜂卵的进一步发育,卵壳下的浆膜已分化为细胞,即将在蜂卵孵化时形成游离的畸形细胞。此时蜂卵已发育33h,其卵壳表面的乳头状突起非常明显,长度可达1.167μm。此外,在突起的末端有细丝状物伸出(图1:d)。当产卵35h时,蜂卵表面已没有任何物质覆盖,卵壳内是发育着的胚胎,胚胎外是包裹的浆膜细胞(图1:e)。通常,蜂卵经过36～40h的胚胎发育后,菜蛾盘绒茧蜂幼虫孵化,同时释放畸形细胞到寄主小菜蛾的血腔中。2.2蜂卵表面vlfs的存来自卵巢管的蜂卵,其表面没有观察到VLFs,只有纤维层或卵壳突起(图1:a)。而透射电镜结果显示,在输卵管萼区的蜂卵与CvBV之间有大量VLFs存在,从卵壳表面到最外层厚度约为800nm(图2:a)。对来自输卵管萼区的蜂卵进行透射电镜观察发现,自蜂卵壳表面到最外层的厚度平均达350nm,再次说明除卵壳的纤维层外还有VLFs的存在(图2:b)。进一步从输卵管萼区来源的蜂卵表面可以看到堆积在一起的长的VLFs(图2:c)。扫描电镜结果也显示,蜂卵表面密被有浓密的纤丝状物(图2:d)。2.3种寄生虫因子的相互关系在菜蛾盘绒茧蜂的卵巢萼区,有大量的CvBV粒子充满在成熟卵周围。图2(a)显示蜂卵卵壳表面的纤维突起、覆盖着的VLFs以及最外围异常丰富的CvBV粒子。寄生后0.5h,产在寄主小菜蛾体内的蜂卵表面依然可以清晰地观察到上述3种寄生因子(图3:a)。产卵后2h,只能明显地观察到纤维层和少量的CvBV粒子(图3:b)。说明CvBV粒子只是在产卵过程中随蜂卵注入寄主体内,作短暂的停留后即扩散并开始侵染寄主组织细胞的活动。2.4假寄生虫期蜂卵表面形态变化若正常产卵寄生,菜蛾盘绒茧蜂卵通常在36h左右孵化。因此,在假寄生后的36h内每隔2h定时解剖,从未发现蜂卵被包囊,也无寄主血细胞的黏附。正常寄生3龄小菜蛾后的菜蛾盘绒茧蜂卵均能成功孵化,发育正常。这说明在菜蛾盘绒茧蜂胚胎发育时期,完全可以克服寄主免疫系统的攻击。在假寄生后3d内未发现有蜂卵被血细胞包囊或发生黑化现象。绝大多数蜂卵表面光滑(图4:a)。但在假寄生6d后,60%以上的蜂卵被血细胞黏附或发生局部黑化,只有少数蜂卵保持正常,但从未出现包囊现象(图4:b)。假寄生后,连续8d解剖观察蜂卵的包囊及黑化情况,没有发现蜂卵被包囊,说明CvBV基本可以抑制寄主的免疫反应,保护寄生蜂在一个免疫系统被抑制的寄主环境中正常完成卵期和幼虫期的发育。假寄生后7～17d的蜂卵表面出现血细胞黏附和黑化比例增多现象(图4:c～i),这表明寄主血细胞和体液的免疫能力有所恢复。图5结果显示,从假寄生后第4d起,蜂卵表面血细胞黏附的比例开始增加,蜂卵表面发生局部黑化;并随假寄生时间的延长,蜂卵表面血细胞黏附以及黑化的程度加剧(图5)。以上结果表明,被假寄生后的小菜蛾幼虫,在缺乏菜蛾盘绒茧蜂幼虫和浆膜来源的畸形细胞情形下,在只有CvBV和毒液等主要寄生因子的作用下,其免疫反应能力在假寄生初期被完全抑制,但在后期有一定程度的恢复。然而,在长达17d的观察时间内,蜂卵从未发生被包囊的事实则证明了CvBV和毒液的免疫抑制能力很强并且较持久。从假寄生17d的蜂卵周围成团的血细胞也说明,小菜蛾幼虫的血细胞免疫能力受到抑制。3讨论3.1寄生蜂卵表面的纤维层和hf-pbs通过dv重组蛋白检测cdv蛋白表达寄主昆虫的免疫系统能有效识别和排除异物的入侵,相应的寄生蜂也进化产生了多种策略加以克服。寄生蜂产卵时将毒液和卵巢萼腺的分泌物也一同注入寄主体内(StrandandPech,1995;Beckage,1997)。卵巢萼液中最关键、最主要的成分是PDV,这通过假寄生及随后注射PDV抗体得到了证实(SollerandLanzrein,1996)。PDV在抑制寄主血细胞包囊的同时,还有抑制血淋巴黑化的能力。然而,PDV基因编码的免疫抑制蛋白在寄生后不能立即表达,如在注入PDV后3h内,寄主血细胞形态并没有改变,这说明PDV在寄生初期不可能保护蜂卵免受寄主血细胞的包囊(Edsonetal.,1981)。而此时,寄生蜂卵表面的成分似乎首先起到保护蜂卵的作用(DaviesandVinson,1986;Kinuthiaetal.,1999)。微红盘绒茧蜂C.rubecula卵表面一种32kDa的蛋白,被证实在PDV基因编码的免疫抑制蛋白表达之前起保护蜂卵的作用(Asgarietal.,1997,1998)。经崩溃酶(driselase)处理的成熟的黑头折脉茧蜂C.nigrceps蜂卵因表面纤维层的去除而被包囊,而那些表面具有纤维层的蜂卵,却可以逃避寄主的免疫识别而不被包囊(DaviesandVinson,1986)。同样,对于一种多胚发育的寄生蜂,注射非成熟卵和经酶处理的成熟蜂卵于寄主体内后,2h即被包囊;与之相反,成熟卵则不被包囊,它们的区别就在于纤维层的有无。因此,成熟卵表面的纤维层可能在保护蜂卵免受寄主免疫攻击中发挥重要作用(Huetal.,2003)。有些寄生蜂卵巢萼液中有类病毒样颗粒(viruslikeparticles,VLPs)或VLFs,它们在卵萼细胞中复制。VLPs或VLFs贴附在蜂卵的表面,为蜂卵营造了一个类似寄主物质的外壳,使蜂卵在PDV基因表达并起作用前,被动保护蜂卵不被寄主免疫系统识别,从而不受寄主血细胞的攻击。如Tanaka(1987)报道了中红测沟茧蜂输卵管萼液中含有具有DNA分子的VLFs。这种VLFs黏附在蜂卵的表面,对蜂卵起保护作用。3.2蜂卵表面突起物vlfs的作用上述的免疫抑制因子信息均来自不同的寄生体系。但对于同一个寄生体系,又有哪些免疫抑制因子?各因子作用的时效性又如何?通过电镜观察,在菜蛾盘绒茧蜂-小菜蛾寄生体系中,我们发现蜂卵表面可分为卵壳表面纤维层以及外层的VLFs,这从扫描电镜以及比较来源于不同卵巢部位的蜂卵表面结构得到了证实。VLFs为卵萼中蜂卵所特有,但随蜂卵注入寄主体后,短暂地与PDV存在于蜂卵表面,随后扩散到寄主的血腔中。而蜂卵卵壳的突起物在寄生33h后依然存在,同时可以看到从突起物的末端伸出丝状物,这与Norton和Vinson(1977)的观察结果相一致:他们发现,丝状物从卵壳的几个突起物伸出并进入寄主血细胞的细胞质中,表明在无其他免疫因子存在的情况下,卵表面突起物对蜂卵起到最初的保护作用。无论是蜂卵表面的纤维层还是VLFs,随蜂卵注入到寄主体后,在寄生的初期,面对寄主的免疫攻击,以被动防御的方式首先对蜂卵起到保护作用。随后,包裹在蜂卵表面的絮状VLFs也如同PDV粒子一样释放到寄主的血淋巴中。随着内寄生蜂胚胎的发育,纤维层不再形成保护层,此时,PDV的免疫抑制基因开始在小菜蛾血细胞等部位表达(Chenetal.,2007,2008),主动攻击寄主的免疫系统。3.3寄生蜂对小菜红岩总体的免疫抑制作用PDV对寄主的免疫抑制可能是瞬时的,也可能是长久的(Beckage,1998),不同的寄生体系存在着差异。特别是茧蜂属PDV的作用就更为复杂,有的种类是瞬时的,有的种类则具长久的抑制作用。为避免发育胚胎在发育过程中可能向寄主血淋巴中释放免疫抑制剂如畸形细胞或其他物质,我们通过γ-射线辐射处理菜蛾盘绒茧蜂雌成蜂,使其产在寄主小菜蛾体内的卵成为不育卵即造成假寄生。在这样的条件下,可以排除发育胚胎、浆膜释放的畸形细胞和蜂幼虫的干扰,完全模拟正常寄生状态下,生理剂量的蜂卵