bmpr-ib基因多态性与绵羊产酪数的关联研究

bmpr-ib基因多态性与绵羊产酪数的关联研究

目前，世界绵羊业发展的总趋势是从“以毛为主”向“以肉为用”的转变。在生产上，传统的“人工养殖”方法逐渐被用来代替。同时,肥羔生产以其诸多优点和较高的经济收益在世界养羊业国家越来越受到青睐。绵羊的多胎是绵羊业多产、高产的基础。一般来说,家畜的繁殖性状是受多基因控制的数量性状,传统的选择方法对其遗传进展的改良是很慢的,分子标记辅助选择为解决这一问题提供了新的方向和契机。分子标记辅助选择可以消除性别、年龄、环境等因素对表型选择的干扰,从而可以弥补常规表型选择方法的不足。在绵羊繁殖性状的分子标记研究中,工作主要集中在对多产性状的主效基因的寻找和判定上。1991年,澳大利亚和新西兰的科学家研究证实了Booroola羊高繁殖力属于常染色体单基因遗传,遗传突变是由碱基的点突变、重复或缺失引起的(Davis等,1991)。该基因被绵羊和山羊遗传命名委员会命名为FecB(即Fec=fecundity,B=Booroola)。来源于澳大利亚美利奴Booroola品系的母羊具有高排卵率和产羔数多的特点,这种高繁殖率的表型是由于其携带FecBB等位基因的作用。Souza(2001)和Mulsant(2001)等分别研究表明绵羊FecB基因实际为骨骼形成蛋白白IB型受体(BMPR-IB)基因,由于该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酸变化为精氨酸(Q-R),并且证明249R就是FecBB等位基因。绵羊的该基因被定位于6号染色体上,编码区由10个外显子组成,共1509bp,编码502个氨基酸(Souza等,2001;Mulsant等,2001)。BMPR-IB基因在与绵羊繁殖有关的组织和器官中都有广泛的表达,如卵巢、睾丸、子宫和前列腺,并且在脑、骨骼肌和肾脏中也有中度的表达(Wilson等,2001)。新疆农垦科学院畜牧兽医研究所从1981年开始从中国美利奴细毛羊中将连续产双胎、多胎的母羊集中起来,用多胎公羊配种,选育多胎绵羊品系。为加快培育进程,在本品种选育的同时,引入多胎绵羊品种湖羊进行适度杂交,从杂交后代中选出符合中国美利奴品种一级标准的、含1/4湖羊血的祖公羊和继代公羊,经过严格的选种选配和横交固定,已经育成中国美利奴肉用和毛用多胎品系。本研究以BMPR-IB基因为候选基因,在湖羊、中国美利奴单胎品系和中国美利奴肉用和毛用多胎品系中研究该基因的变异与绵羊多产性状之间的关系,为绵羊繁殖性状的分子标记辅助选择提供理论依据。1材料和方法1.1中国美利奴肉和毛用dna的制备分别取47只中国美利奴单胎品系、38只中国美利奴肉用多胎品系、49只中国美利奴毛用多胎品系和38只湖羊耳组织样,酚、氯仿抽提DNA之后,-20℃保存。1.2引用材料的设计与合成根据绵羊BMPR-IB基因序列设计并合成1对引物BMPR-IB-1和BMPR-IB-2,引物由上海博亚生物公司合成。1.3pcr扩增条件及酶切反应体系利用BMPR-IB-1和BMPR-IB-2引物对上述不同品种(系)羊的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系中包含1×PCR反应缓冲液、0.16mmoldNTP、引物各5pmol、1UTaq酶和50ng基因组DNA,加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5min;94℃30s,60℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸5min。用限制性内切酶AvaII对PCR产物进行酶切,酶切反应体系中包含1×AvaII酶切缓冲液、5ulPCR产物和10UAvaII内切酶,加水至总体积为20ul,酶切反应条件为37℃温育3h。酶切反应之后将20ul消化液全部加样于2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。2结果2.1pcr扩增结果PCR产物如图1所示,在100bp和200bp之间有一条特异性片段,与预期扩增片段大小一致,可以直接进行RFLP分析。2.2pcr-rflp电泳结果由于绵羊BMPR-IB基因在746处有1个单核苷酸多态(A-G突变),因此该位点为G时,会产生限制性内切酶AvaII的酶切位点(GGACC),AvaII酶切PCR产物后会产生2个片段(110bp和30bp);该位点为A时(AGACC),则不存在AvaII酶切位点,酶切PCR产物后还只有1个片段(140bp);该位点为A/G杂合时,酶切PCR产物后会产生3个片段(140bp、110bp和30bp)。PCR-RFLP电泳结果如图2所示,在所有供试的羊群中共产生3种基因型,其中只有110bp片段的被命名为BB基因型;只有140bp片段的被命名为++基因型;有140bp和110bp两个片段的被命名为B+基因型。2.3利奴单胎品系基因型及等位基因频率表1结果表明,在湖羊品种中以BB基因型为主,B等位基因频率为0.92,+等位基因频率为0.08;在中国美利奴单胎品系全部为++基因型;中国美利奴肉用和毛用多胎品系中以B+基因型为主,B等位基因频率分别为0.38和0.48,+等位基因频率分别为0.62和0.52。将不同基因型与不同绵羊品种(系)进行卡方独立性检验,结果表明中国美利奴肉用和毛用多胎品系间基因型频率差异显著,其它不同品种(系)间基因型频率差异极显著(表2)。2.4基因型母羊对产养的预测情况BB和B+基因型的母羊预测每胎产2羔或2羔以上,++基因型的母羊预测每胎产1羔。2002年9月份配种,2003年3月份统计产羔情况,结果见表3。由表3可知,BB基因型母羊预测产羔情况与实际产羔情况的符合率为78.8%,B+基因型为80.4%,++基因型为80.0%。B等位基因具有明显的显性效应。3不同品系中bmpr-ib基因多态性分析BMPs是TGF-β超家族中的最大的一类亚家族成员,它的主要功能是参与并调节骨组织的生成和分化,对动物的生长发育起到重要的作用,而目前对它在繁殖机能方面的作用了解的甚少(Soyun等,2001)。Wilson等(2001)通过对不同羊群的BMPR-IB基因A476G突变位点进行检测,结果只在含有澳大利亚美利奴Booroola品系血统的羊群中检测到该突变位点,而在与美利奴Booroola品系无关的羊群中未检测到该突变位点。湖羊是中国特有的具有高繁殖性能的品种,但对于它的高繁殖性能的机理尚不清楚。本研究以湖羊、中国美利奴单胎品系及它们杂交的后代中国美利奴肉用和毛用多胎品系为实验材料进行BMPR-IB基因多态性分析,结果表明BMPR-IB基因这些群体中存在多态性,在湖羊群体中检测到的BB基因型与澳大利亚美利奴Booroola品系中BMPR-IB基因的突变型(FecBB等位基因)是相同的,而该基因型在中国美利奴单胎品系中未检测到。群体遗传学分析表明基因型分布在不同繁殖性能的羊群中有明显差异。湖羊的繁殖力最高,在检测的样本中,湖羊有84%的个体为BB基因型,B基因的频率为0.92;美利奴单胎品系的繁殖力最低,对该品系中的47只羊进行检测,没有发现BB基因型个体,B基因的频率为0。这一结果暗示BMPR-IB基因可能与绵羊的繁殖性状有关。为了进一步验证和研究BMPR-IB基因对绵羊产羔数的影响,对母羊进行个体标记并检测基因型,记录每只母羊的产羔数,结果发现BB和B+基因型个体的平均产羔率分别为209.1%和208.7%,而++基因型个体的平均产羔率仅为120