上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征分析

上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征分析

近年来，副溶血弧菌（vp）已成为中国的主要食品来源性疾病，也是浦东夏季和秋季细菌感染腹泻的主要原因。随着分子生物学技术的发展与运用以及PulseNetChina的建立,病原菌分子分型监测逐渐成为我国未来细菌性传染病病原体实验室监测的发展方向,目前作为细菌性传染病分子分型“金标准”的脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)技术已被纳入监测网络体系。本研究对2010-2011年上海市浦东新区散发感染性腹泻患者、食物中毒、监测食品中分离的副溶血弧菌菌株进行药物敏感性、血清学和PFGE分子分型分析,旨在为副溶血弧菌感染暴发的早期预警、分子流行病学调查及溯源提供准确的实验室数据,为最终建立副溶血弧菌PFGE分子分型数据库奠定技术基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病例来源,指征点描述,低血压监测的病例数据来源是以“国家食实验菌株共505株,分离自浦东新区2010-2011年的散发病例299株、食物中毒81株、监测食品样本125株,其中2010年有318株菌(散发病例151株,食物中毒62株,监测食品105株),2011年有187株(散发病例148株,食物中毒19株,监测食品20株)。散发病例分离株来源于浦东新区19个腹泻监测点(仁济、东方、南中心、七院、公利、浦南、浦人医、泥城、沪东、金杨、花木、机场镇、大团、祝桥、周浦、高东、潍坊、航头、三林),食物中毒分离株来源于食品与药品监督所(FDA)送检的食物中毒标本,监测食品分离株来源于3个监测点(世博、临江、沪东)。作为PFGE实验分子质量标准对照的布伦卢普沙门菌(Salmonellabraenderup,H9812)和药敏质控菌株大肠埃希菌ATCC25922,由上海市疾病预防控制中心(CDC)微生物实验室提供。1.1.2重组人组织型细胞菌群MH琼脂(OXOID),药敏纸片(OXOID),O抗原、K抗原诊断血清(日本生研株式会社),蛋白酶K(Promega),限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ(TaKaRa),SeaKemGoldAgarose(Cambrex),10×TBE(BIO-RAD)。均在有效期内按试剂说明使用。1.1.3脉冲场凝胶电泳仪、bio-radmope-mapper水浴箱(37℃、56℃),56℃水浴摇床,菌液比浊仪(BioMerieux),脉冲场凝胶电泳仪(Bio-RadCHEFMapper),凝胶成像系统(Bio-RadChemicDocXRS+),BioNumerics分析软件(BioNumericsVersion6.64)。1.2方法1.2.1对菌株的分离和鉴定1.2.2o抗癫痫试验1.2.3设属gentamicin,细价,ue,coe,k采用CLSI推荐的Kirby-Bauer法,12种药敏纸片分别为氨苄西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林/克拉维酸(Amoxycillin/clavulanicacid,AMC)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)、阿米卡星(Amikacin,AK)、庆大霉素(Gentamicin,CN)、四环素(Tetracycline,TE)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)、氯霉素(Chloramphenicol,C)、复方新诺明(Sulphamethoxazole/trimethoprim,SXT)。参照美国CDC公布的PulseNetPFGE分子分型标准化实验室操作,进行胶条的制备、胶条中细菌的裂解、裂解后的洗涤,用NotⅠ进行酶切,分子质量标记H9812用XbaⅠ酶切,脉冲10～35s,电泳18h,用0.03%的Gel-Red染色30min,用超纯水脱色1h,成像仪内获得凝胶图像,运用BioNumericsVersion6.64分析软件对图谱进行聚类分析。2结果2.1菌株“o”群缺失分型所有菌株均未出现自凝现象,505株菌株中有117株未能分型,其中5株菌株“O”群未能分型,112株“K”型未能定型,分别占散发病例、食物中毒、监测食品分离株的7.69%(23/299)、9.88%(8/81)和68.80%(86/125)。505株副溶血弧菌血清型分布情况见表1。2.1.1血清型两组患者的血清型两组5.2%监测食品分离株的血清型分布均呈现多样性,O3∶K6型仅为1株。2010年居前2位的血清型别为O2∶K3(5.71%)和O2∶K28(2.86%),O3∶K7、O1∶K37、O11∶K61和O4∶K34(1.90%)血清型并列第3位;2011年O5∶K17(10.00%)血清型占首位,O1∶K25、O3∶K7、O2∶K3和O3∶K56(5.00%)血清型并列第2位。2.1.2k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k9k6k6k6k9k6k9k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k6k69.13%(56/81)的分离株为O3∶K6型,2010年居前3位的血清型别为O3∶K6(74.19%)、O4∶K8(4.84%)和O1∶K36(4.84%),2011年为O3∶K6(52.63%)、O4∶K9(21.05%)和O1∶K36(10.53%)。2年中均出现的血清型为O3∶K6、O1∶K36和O4∶K9。2.1.3年中2年血清型61.87%(185/299)的分离株为O3∶K6型,2010年居前3位的血清型别为O3∶K6(58.28%)、O4∶K8(11.92%)和O1∶K56(10.60%),2011年为O3∶K6(65.54%)、O4∶K9(6.08%)和O8∶K41(6.08%)。2年中均出现的血清型为O3∶K6、O4∶K8、O1∶K56、O3∶K29、O1∶K36、O4∶K8和O4∶K9。2010-2011年患者分离株的优势血清型为O3∶K6型。2.2阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星的耐药率见表2,表3。505株菌株对氨苄西林的耐药率为99.14%(502/505),对其余抗生素均有较高敏感性。2010年分离株的耐药率与2011年相似,但2011年的分离株对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星的敏感率低于2010年。耐2种或以上抗生素的菌株有8株,其中1株(监测食品)对氨苄西林、四环素、环丙沙星耐药,为多重耐药菌株,7株对氨苄西林、阿米卡星耐药。2.3菌株基因组dna片段分离505株菌株经限制性内切酶NotⅠ酶切后进行PFGE,所获得片段的分子质量介于20～700kb,其中26株菌株未能分型(散发病例9株,食物中毒16株,监测食品1株),其他各菌株(包括“O”、“K”抗原未能鉴定的菌株)基因组DNA片段分离良好。相似性系数为100%的是同一带型,有1条或以上条带差异为不同带型。479株菌株共获得221个PFGE带型,分别标记为K16N11.PD0001—K16N11.PD0221。2.3.1分离株与参数检验病例的相似性分析可分型的124株监测食品分离株共获得120个带型,其中4个型各有2株菌株,其余各型均分别只有1株菌株,无优势带型,呈现遗传多样性,并且未得到与散发病例或食物中毒分离株相同的PFGE带型。在5株与当年散发病例或食物中毒来源的具有相同血清型的菌株中,食品分离株K16N11.PD0058(O3∶K6)与患者分离株K16N11.PD0038、K16N11.PD0039、K16N11.PD0040等其他共25个(共241株O3∶K6型菌株)PFGE带型相似性系数为82.6%,与相邻时间发生的食物中毒及散发病例分离株K16N11.PD0035、K16N11.PD0039、K16N11.PD0044之间的相似性系数亦为82.6%。食品分离株K16N11.PD0199(O3∶K7)与患者分离株K16N11.PD0070(O3∶K7)相似性系数为64.8%,食品分离株K16N11.PD0079、K16N11.PD0175(O4∶K34)与患者分离株K16N11.PD0073(O4∶K34)相似性系数为64.8%,食品分离株K16N11.PD0099(O4∶K63)与患者分离株K16N11.PD0198(O4∶K63)相似性系数为54.0%,提示这些监测食品与患者分离株间遗传关系较远,见图1。2.3.2子分型对犯罪的影响2010-2011年共发生20起食物中毒事件,其中2010年15起,2011年5起,PFGE带型分布情况见表4,食物中毒分离株与相邻日期的散发病例分离株在分子分型水平上不具相关性。K16N11.PD0044为优势带型。2起食物中毒事件(见表4中序号14、16)同时在患者与疑似食品中分离到副溶血弧菌,但PFGE带型不相同,提示疑似食品不是引起此次食物中毒的传染源。有30%(6/20)的食物中毒事件,分离株中的PFGE带型有2个或以上,提示感染来源自不同的遗传株系。K16N11.PD0044、K16N11.PD0016、K16N11.PD0043型在2年中各引起2起或以上的食物中毒事件,提示浦东新区存在被这些株系污染的传染源。2.3.3k133带型24.08%(72/299)的散发病例分离株PFGE型别是K16N11.PD0044,为优势带型。2010年散发病例分离株中占前2位的PFGE带型为K16N11.PD0044和K16N11.PD0036,K16N11.PD0013和K16N11.PD0038带型并列第3位,2011年前3位的优势带型为K16N11.PD0044、K16N11.PD0038和K16N11.PD0054。两年都出现K16N11.PD0044、K16N11.PD0036和K16N11.PD0038这3个带型,且型内均含有多株菌株,提示浦东新区长期存在着这3个株系的传染源。在相同或不同的时间、腹泻监测点之间存在完全相同的PFGE带型,提示存在多起疑似聚集性病例事件,见表5。相同PFGE带型内的菌株血清型相同,但相同血清型可以有多个PFGE型别。2.3.4耐2种药物敏感菌株的pfge带型检测1株多重耐药菌(菌株号10130,PFGE型K16N11.PD0105)与最相近带型的相似性系数为88.9%,7株耐2种抗生素的菌株中2株(菌株号11160、11161)未能分型,其余5株(菌株号11044、11038、11100、11124、11120)与最相近带型的相似性系数分别为72%、83.9%、87%、92.6%和97.3%,提示耐药菌株与敏感菌株的PFGE带型不同。3同起试验菌株pfge分析结果血清型分型技术操作简单,结果即时可得到,但是由于多种因素常致使菌株,尤其是食品分离株无法定型。本研究的505株菌株中有117株血清型无法分型,但这些菌株均能运用PFGE进行分型。尽管本次研究中亦有26株菌株PFGE未能分型,但远低于血清学未能分型的菌株数。这些菌株在排除了样品浓度过高、电泳液温度过高、凝胶浓度过低或混有杂质等影响因素,并在电泳中加入硫脲后依然未能分型,因此彻底解决未能分型这一问题还有待于进一步深入的研究。本次研究结果显示63.42%(241/380)的散发及食物中毒患者分离株血清型为O3∶K6,与国内外报道的结果相类似,O3∶K6血清型的高感染率可能是由于此血清型比其他血清型更容易导致腹泻与感染。PFGE数据库显示K16N11.PD0044为血清型O3∶K6的优势带型,菌株来源于不同或相同的时间、监测点的散发病例以及FDA送检的食物中毒患者分离株,K16N11.PD0044在2010年和2011年分别引起5起和2起食物中毒,说明这一带型的菌株长期存在于浦东新区,但与在监测食品中得到的1株O3∶K6型菌株相比较,两者的PFGE分子分型相似性系数为82.6%,因此在此次研究中无法确定污染源。根据聚类分析判断原则,带型相似性系数在100%的菌株为高度成簇性的菌株,在有流行病学信息支持的前提下,可认为这些菌株为同起暴发菌株,来源于暴发病例或相关的聚集性病例事件。本次研究结果显示2010-2011年发生多起疑似聚集性病例事件,有的发生在相同时间、相同地点,例如,2011年5月11日来自金杨的3株散发病例分离株是K16N11.PD0005型(O1∶K36),还有的是发生在相邻时间、不同地点的疑似聚集性病例事件,例如K16N11.PD0021型内有3株(O4∶K8)菌株是分离自2010年6月29日在祝桥就诊的腹泻患者,同年7月2日在金杨就诊的腹泻患者分离株中也得到与此相同的带型,提示这两个相距60余公里的监测点内4个患者可能为同一聚集性病例事件,但仍需流行病学方面的证据来加以证实。当持续出现相同PFGE带型的时候应引起警惕,例如,在2010年7月下旬至8月中旬泥城的散发病例中分离到K16N11.PD0019(血清型为O4∶K68)型菌株,在9月上旬食物中毒中也分离到这个型别的菌株,说明浦东地区存在被该株系污染的传染源。在2011年8月下旬南中心的散发病例中分离到K16N11.PD0018(血清型为O4∶K68)型的菌株,与K16N11.PD0019相似性系数为94.4%,提示两者遗传关系较近。O4∶K68与O3∶K6在20世纪末曾是东南亚多国的流行株,近年来也是莫桑比克等国的流行株,但O4∶K68不是浦东新区的优势血清型,尽管如此,本次研究中PFGE分析结果提示我们应该密切注意这个株系的发展。2010-2011年共发生20起由副溶血弧菌感染的食物中毒,通过PFGE分析,可以推测其中11起的感染来源于同一传染源。如果可以同时得到疑似食品与患者分离株,通过PFGE分析结果并结合流调资料,便可以查寻到传染源,但只有2起食物中毒事件同时得到患者与疑似食品分离株,并且两者在分子分型上不具相关性,说明疑似食品与暴发事件没有关系。其余18起食物中毒事件均未能同时得到患者与疑似食品分离株,杨丽华等研究中也出现相同情况,因此需要我们在疑似食品的选择、采样、储藏、运输、检测方法等方面严格把关,提高细菌的阳性检出率,为流行病学调查提供完整的食物中毒证据链。尽管本次研究的监测食品分离株与患者分离株在分子分型上不具相关性,提示这些监测食品不是引起浦东新区副溶血弧菌食源性疾病的高危食品,但Alam等研究发现有2株食品分离株与引起多国大流行的临床分离株在PFGE型别上具有同源性,2012年日本也报道海产品分离株与流行株在PFGE型别上具有同源性,因此持续对水产品中副溶血弧菌进行监测及同源性分析十分必要,