第02章-酶分析法

第二章酶分析法第一节酶分析法的基本知识1.1酶分析法的两种类型1.2酶分析法的特征1.3酶分析法的意义第二章酶分析法第一节酶分析法的基本知识第二节酶活力的测定第三节酶法分析第四节酶循环分析法第五节固定化酶在酶分析中的应用蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物催化剂，它和生命活动密切相关。因此，酶学在生产实践基础理论研究方面，都起着非常重要的作用。酶分析法则是其中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反应的能力，对化学分析有很大的用处。酶的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制剂以及酶本身的测定。在19世纪中叶已采用酶法来测定糖类。20世纪40年代初，Warburg提出基于使辅酶还原而用光度法来测量NAD和NADP的方法。最新的发展是电化学法与荧光法的应用。酶分析法已成为一项公认的分析技术。1.1酶分析法的两种类型一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定，通常称为“酶活力测定”。另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等，一般称为“酶法分析”。两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法。1.2酶分析法的特征①选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。②灵敏度高。一般可测到10-7mol/L。如果与荧光法联用，可高达10-9mol/L左右。③反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在30分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。④酶用量甚微，所以比较经济。⑤精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。⑥适用范围有一定局限性。只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。⑦简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。1.3酶分析法的意义酶的应用大致可分为四个方面：(1)用以制造某些产品；(2)用以去除某些物质；(3)用以识别某种化合物；(4)用以测定某种物质。(1)和(2)应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。(3)和(4)属于酶分析法的范畴。酶分析法迅速扩展一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获得各种酶制剂。第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶的固定化技术有了很快的发展，使酶的反复使用和连续使用成为可能。固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。另一方面也正在进一步简便化，或制成含酶的试纸，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等方面广泛应用。如用葡萄糖氧化酶(EC．1．1．3．4)测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标。第二节酶活力的测定2.1酶活力单位和反应初速度2.2反应条件的确定2.3测定方法1.酶活力的概念2.酶活力的测定方法2.1酶活力单位和反应初速度2.1.1酶量常用酶活力单位表示。酶活力单位是指在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量。酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示(U/g或U/mL)。①1959年国际生物化学协会酶委会接受了Racker等人的建议，采用了“国际单位”表示酶活力。国际单位IU：25℃，最适pH，最适底物浓度下，每分钟催化1μL底物反应的酶量。当底物为蛋白质、多糖等包括多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键变化表示酶单位；对于反应：A+B→C+D，可用两微摩尔A的变化计算酶单位。②1972年酶委员会又提出一种新单位Katal。在确定的最适反应条件下每秒钟催化1摩尔底物变化所需要的酶量为1Kat。1Kat=60×106IU。③在实际工作中,为了简便，人们往往采用各自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得的物理量表示。如以光吸收的变化值(△A/△t)表示酶单位。④在估计酶制剂纯度时则用比活力，即以单位重量的酶蛋白中酶的单位数⑤在酶高度纯净，且酶的分子量和每个酶分子上的活性中心数目已知时，可采用分子活力或转换率(TN)表示。TN表示在最适条件下每个酶分子或每个活性中心每分钟催化底物分子(或相关基团)转化的数目，这种单位的意义是它可用以进行酶催化效率的估计和比较。2.1.2反应初速度酶促反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。以产物或底物变化量对时间作图，可获得“酶反应进程曲线”，这条曲线的斜率就代表酶反应速度。酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定求得酶的浓度或含量。测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。2.2反应条件的确定选择反应条件的基本要求是，所有待测定的酶分子都应能正常地发挥作用。也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处于最适条件。2.2.1底物①底物(包括人工合成底物)最好在物理化学性质上和产物不同。有些酶作用的底物和产物本身就有这种特点，如脱氢酶用的NAD(P)+和NAD(P)H；有的则需加工成色源或荧光源底物，在酶作用后产物产生颜色或荧光。如磷酸酯酶测定可用对硝基苯磷酸。②底物浓度为了使酶反应速度不受它的限制，反应系统应该使用足够高的底物浓度。判别标准是Km例如选用[s]=100Km，因为这种情况下反应速度可达最大速度的99％。大多数酶具有相对的专一性。在可被它作用的各种底物中一般选择Km小的作测定用的底物。③底物表现高底物浓度抑制，或者溶解度小，或者具有毒性，或者较为昂贵而不能使用高浓度，同时又没有其它适宜的底物可以替用时，就只能根据具体的条件，选择一个恰当的底物浓度。并确定在该浓度条件下酶反应的动力学级别。如：酵母的蔗糖酶受高浓度蔗糖抑制，故一般测定时选用5％左右的蔗糖浓度，此时反应为零级。2.2.2pH值H+能对酶反应产生多种影响：①可能改变酶活性中心的解离状况，升高或降低酶的活性；②可能破坏酶的结构与构象导致失效；③可能作用反应系统的其它组成成分影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方向。如：乳酸脱氢酶反应在pH7时向乳酸生成方向进行，而pHl0时则倾向于丙酮酸的形成。在进行酶活力测定时要注意选择适宜的反应pH，并将反应维持在这一范围内。有些酶反应的最适pH可能因反应的温度与底物浓度而不同。例如，碱性磷酸酯酶的最适pH在25℃、30℃和37℃分别为10.3、10.1和9.9。酶反应缓冲系统的离子的pK值应接近要调整的pH。①磷酸缓冲液适用于pH低于7.5的反应系统，②Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液适用于高于pH7.5的反应体系。③Gly-Gly(甘氨酸二肽)在pH大于8时是出色的缓冲系统。缓冲离子不同，可能影响酶的活性水平，甚至最适pH。缓冲离子也可能与酶活性的必需成份形成配合物而导致酶活性的抑制。如，磷酸能与多价阳离子如Ca2+

等结合，硼酸能与多种有机化合物如呼吸链中间递体结合，从而抑制相应的酶活性。2.2.3温度直接影响化学反应速度本身，也能影响酶的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。温度变化1℃，速度可能相差10％以上。要得到可以高度重复的结果，温度变动应控制在±0.1℃以内。生化联合会在1961年建议以25℃为酶的反应测定温度，到1964年则建议改为30℃；国际临床化学联合会也建议采用30℃。但是许多临床化学工作者常采用37℃为酶反应温度。2.2.4辅助因子有些酶需要金属离子有些酶则需要相应的辅酶物质，在反应系统中应该满足酶对这些辅助因子的需要，而且在添加这些物质时还应注意到它们的专一性，以及某些活化剂在高浓度时可能产生抑制作用。为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时也需要某些相应的物质。例如，对巯基酶可加入巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。在制备样品和反应过程中为了避免待测酶遭受蛋白酶的降解，往往要加入蛋白酶的抑制剂。2.2.5样品许多待测样品常常包含各种干扰因素，如可能存在着作用同一底物或产物的其它酶。因此测定前应检测系统中是否杂有这些干扰因素。同时采用不同的测定方法和同时检测底物和产物的变化量，然后观察测得的结果是否一致。通过这些比较分析，确定是否存在干扰。例：谷丙转氨酶(GPT)或谷草转氨酶(GOT)可催化氨基的转移。①测定方法是偶联一个脱氢酶反应。前者可偶联乳酸脱氢酶(LDH)，后者可偶联苹果酸脱氢酶(MDH)，然后测定反应过程中NADH在340nm光吸收的降低。②在这些测定样品中，如果包含有谷氨酸脱氢酶(GluDH)，那么就可能产生干扰。反应平衡倾向于形成L-Glu，它同样导致340nm光吸收下降。GluDH在正常血清中极少，在脑、肝等组织中极为丰富。在某些病理条件下血清中这种酶活性可能显著升高。该酶反应需要NH4+而且其Km很大，如果反应系统能够避免NH4+，那么这种干扰就可消除。同时进行空白试验。2.2.6空白和对照空白是指杂反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可通过不加酶，或不加底物，或二者都加，但酶预先经过失效处理的反应系统获得。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。2.3测定方法测定方法有取样法和连续法。取样法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。连续法：基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接、连续观察的方法。2.3.1光吸收测定法根据产物和底物在某一波长或某一波段上，有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。①光吸收测定法应用的范围很广。几乎所有氧化还原酶都可用此法测定。例1：脱氢酶的辅酶NAD(P)H在340nm有吸收高峰，而氧化型则没有。例2：细胞色素氧化酶的底物为细胞色素c，该物质在还原态时，其550nm的吸光系数2.81×104厘米²/摩尔，而氧化型的0.80×104厘米²/摩尔。这种光吸收差别也可用来进行测定。某些氧化还原酶难以获得天然的供受体，可采用简单的人工供受体(见下表)。②可以利用光吸收测定的-还有那些催化双键饱和化或双键形成的酶反应，以及那些催化环状结构变化的酶反应。例1：延胡索酸酶催化的反应，延胡索酸在300nm有强的光吸收，而苹果酸没有。例2：尿酸氧化酶催化尿酸氧化为尿囊素，尿酸在290nm有吸收，而尿囊素则没有。光吸收测定法的特点是灵敏度高(可检测到nmol/L水平的变化)，简便易行，测定一般可在较短的时间内完成。光吸收法，应用很广，除上述氧化还原酶，许多激酶(转移酶)、酯酶、肽酶等，都广泛采用这类方法。2.3.2荧光测定法如果酶反应的底物或产物具有荧光，则荧光强度变化速度可作为酶反应速度的一个量度。可以应用此法测定酶的反应有两种：一是脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过程就有荧光变化。例如NAD(P)H的中性溶液发强的蓝白色荧光(460nm)，而NAD(P)+则没有。另一类是最近发展起来的，利用荧光源底物的酶反应，例如可用二丁酰荧光素测定脂肪酶，二丁酰荧光素不发荧光，但其水解后释放荧光素。荧光测定法优点：灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高2~3个数量级，因此特别适于酶量或底物量极低时的快速酶分析。与此有关的是荧光光谱与荧光偏振测定。二者近年来广泛用于酶作用机制的研究。荧光测定法缺点荧光读数与浓度问没有直接的比例关系。而且常因测定条件如温度、散射、仪器等而不同。所以如果要将酶活性以确定的单位表示时，首先妻制备校正曲线，根据这曲线再确切定量。该法易受其它物质干扰。有些物质如重铬酸钾常会抢夺能量，降低荧光强度；有些物质如蛋白质能吸收和发射荧光，这种干扰在紫外光区尤为显著，故测定的荧光最好是可见光、特别是红荧光为好。2.3.3电化学测定法灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相比。测定系统中有某些物质污染，不会影响结果。此法要求一定的仪器设备。①离子选择性电极测定法最普通的是以玻璃电极测定酸度(pH)的变化。可用于产酸反应的测定。此法操作简单，但有两个缺点：一是随着反应的进行，pH不断改变，酶活力也将发生变化；二是测定系统的pH依赖于介质的缓冲能力，蛋白质是高缓冲性物质，粗的待测样品中往往包含大量惰性蛋白，因而难以保证恒定的缓冲强度，测定结果不易准确。连续滴定或恒酸滴定可以克服上述困难。所谓恒酸滴定就是在反应过程中，不断向反应系统加酸或碱使pH维持恒定，同时以加酸或加碱的速度代表反应速度。恒酸滴定仪(pH-stat)就是适应这种需要而设计的一种精密测定仪。它可自动加酸加碱控制pH，并记录加入的酸碱量与时何的关系。②氧电极测定法原理：给水溶液中的电极加上一定电压，其中的溶解物质在电极上进行氧化还原反应；产生电解电流。根据电流测定溶质浓度。各种物质产生电极反应所需要加的电极电压是不同的。可以进行选择性测定，例如，溶解氧能在较低的负电压(0.65V左右)条件下还原，而能在这种电极电压水平下发生反应的物质又很少，因此可用来测定氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶等，不过这种方法主要用于线粒体和光合成酶系的研究。③电流测定法原理：把两个电极浸入分析样品中，其间维持一恒定电压，这样反应过程中电流的变化速度将反映酶反应的速度。例：测定葡萄糖氧化酶反应过程中管状铂电极上发生的Fe2+氧化导致电流的变化，这种变化和酶反应速度间有线性关系。2.3.4放射化学测定法放射化学测定法的原理和化学法相似，不过底物用同位素标记。随着酶催化反应进行，将定量地导致放射标记的产物形成。一定时间后，将反应停止并将产物和底物加以分离，然后测定产物的放射性或未反应的底物的放射性，那么转化的底物量也就能推算出来。此法检测的灵敏度可以通过反应时间的控制、比放射性的选择而适当调整。已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。通常用于底物标记的同位素有。H、14C、32P、35S和131I它们在衰变过程中放射的都是β粒子。用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜太高，因为这样可以降低分析成本，避免干扰，减少误差。32P、131I等产生的高能β-射线，可直接用Gerger·miiller。计数器探测计数。但是低能的β-射线(如来自³H、35S)则常用液体闪烁仪检测。放射化学检测法的特点是灵敏度极高，高于光学和电学等方法。可直接用于酶活性检测，也可用于体内酶活性测定。缺点是操作较繁而费时，每个测定都必须进行分离，其次同位素的保存和操作必须特别小心，它直接关系到使用者的健康、安全；另外此法不能进行连续跟踪，故测定时反应时间不能太长，应使底物的转变落在初速度范围内；最后一个问题是辐射线的淬灭，例如。H发射的β-射线可被纸吸收。总的来说，放射化学测定法是一种重要的测定方法。它的应用愈来愈广、愈多，有些酶反应目前还只能采用此法测定。同位素在酶分析上的其它应用可参考有关专著。2.3.4放射化学测定法原理：底物用同位素标记。随着酶催化反应进行，将定量地导致放射标记的产物形成。一定时间后，将反应停止并将产物和底物加以分离，然后测定产物的放射性或未反应的底物的放射性，那么转化的底物量也就能推算出来。此法检测的灵敏度可以通过反应时间的控制、比放射性的选择而适当调整。已知的六大类酶几乎都可以用此法测定。通常用于底物标记的同位素有。3H、14C、32P、35S和131I它们在衰变过程中放射的都是β粒子。用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜太高，因为这样可以降低分析成本，避免干扰，减少误差。32P、131I等产生的高能β-射线，可直接用Geigermiiller计数器探测计数。但是低能的β-射线(如来自³H、35S)则常用液体闪烁仪检测。优点：灵敏度极高，高于光学和电学等方法。缺点：①操作较繁而费时；②同位素的保存和操作必须特别小心，它直接关系到使用者的健康、安全；③不能进行连续跟踪，故测定时反应时间不能太长，应使底物的转变落在初速度范围内；④辐射线的淬灭问题，如3H发射的β-射线可被纸吸收。放射化学测定法是一种重要的测定方法。它的应用愈来愈广、愈多，有些酶反应目前还只能采用此法测定。2.3.5酶偶联分析法应用过量、高度专一的“偶联工具酶”，使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。1．酶偶联分析测活力的实例：例1：如果被测酶反应的产物是某脱氢酶的底物，在这种情况下，可向反应测定系统中．加入足够量的相应的脱氢酶和辅酶，使反应继续进行，然后通过NAD(P)H特征吸收变化而加以测定。其中G和G-6-P-O分别代表葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸-δ内酯)大约有50种左右的脱氢酶可以利用NAD+和NADH，20多种脱氢酶能利用NADP+或NADPH。它们都可用作偶联指示酶。如：己糖激酶(HK)的测定就可在过量的葡萄糖-6-磷酸(G-6p)脱氢酶(G6PDH)和NADP+存在的条件下进行：例2：被测反应不能直接和上述脱氢酶反应偶联，可再插入一个起联结作用的辅助酶反应。如测定肌激酶活力：其中PEP、Pyr和L分别代表磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乳酸；AMP、ADP和ATP分别为腺苷一、二和三磷酸。例3：被测反应和其它有光学性质改变的酶反应偶联，如腺苷酸脱氨酶催化AMP脱氨过程中伴随有265nm光吸收的降低，此酶专一作用于AMP，不作用ADP和ATP。因此在测定某些合成酶或激酶反应时，它可用作偶联指示酶，肌激酶的测定也可利用它：用这两种酶组成偶联测定系统时，由于它们的最适pH相距较远，因而不能在同一系统中进行作用，为此必须分开建立两个反应系统，并在不同时间间隔从肌激酶反应系统取样，然后转入脱氨酶反应系统，最后测定。

2．应用酶偶联测活力应注意的事项首先，加入的偶联工具酶应当高度纯净，尤其不能混有待测酶，也不能混有干扰测定的其它酶。其次，偶联酶的用量必须过量，以保证被测酶的反应速度是总反应系统的限制因子，使测得的反应速度和被测酶浓度呈线性关系。第三节酶法分析应用酶作为分析工具的酶分析法可以对酶的底物、辅酶、活化剂或抑制剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析法、终点测定法和-酶标免疫测定法。终点测定法应用最为普遍。终点测定法是借助某种酶作用，使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质等的变化量。分为单酶反应定量法和偶联酶反应定量法。3.1单酶反应定量法3.2偶联酶反应定量法终点测定法条件

3.1单酶反应定量法单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示用这种反应作底物定量时，可以测定底物的减少量，也可以测定产物的增加量。对含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有效的方法。3.1.1底物减少量的测定在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物(当有99％转化成产物时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有可能直接测定底物的减少量而定量待测物。据此原理能进行测量的物质有胞嘧啶(胞嘧啶脱氨酶反应280nm处吸光度的减少)，腺嘌呤(腺嘌呤脱氨酶反应，280nm处吸光度的减少)以及尿酸等。例：尿酸的定量测定尿酸在293nm、297nm处具有特征吸收峰，其摩尔吸光系数分别为有明显差别。利用这一性质，通过尿酸酶反应，根据它的吸光度的减少就可算出尿酸量。3.1.2产物增加量的测定在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物基本上都能转变成为产物，而产物又具有可专一性进行定量测定的物质，那么，根据产物的增加量就能检测底物的量。如：各种氨基酸类(L-Lys、L-Arg、L-Tyr、L