第七章 微生物的遗传变异和育种

第七章微生物的遗传

变异与育种微生物是遗传学研究中的明星：1.

物种和代谢类型多样性（600万种以上）2.微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。3.易于人工培养，快速、大量生长繁殖。4.对环境因素敏感，易于获得各类突变株，操作性强。模式生物遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。——是一种内在可能性或潜力。

遗传型+环境条件表型表型（phenotype）：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。

——是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢发育变异(variation):生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.性状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883~1889年间德国Weismann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎链球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验F.Griffith，

研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性;R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性

（一）经典转化实验（transformation）1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验

对小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

对小鼠注射活R菌和热死S菌———小鼠死亡

抽取心血分离

活的S菌加热杀死的S型细菌里可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过某种方式进入R型细胞，使其获得S型的遗传特性（2）细菌培养实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。热死S菌—————不生长

活R菌—————长出R菌

热死S菌—————长出大量R菌和10-6SI菌活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌+活R菌平皿培养平皿培养平皿培养1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的是以DNA为遗传物质基础的遗传信息。对各种生化组分进行转化试验（二）噬菌体感染实验（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。

选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）­蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）­蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸,只不过是RNA。（一）7个水平1、细胞水平：大部分DNA都集中在核区或细胞核中，核的数目因微生物种类不同而不同。2、细胞核水平：真核微生物的DNA与组蛋白在一起形成核染色体；原核生物的只有核区。统称为核基因组、核染色体组或基因组。二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式3、染色体水平：不同微生物染色体数目不一样，多数微生物是单倍体，少数情况下是双倍体，如合子。4、核酸水平除病毒的遗传物质有RNA外，其余生物的遗传物质是DNA除病毒的遗传物质有单链的RNA或DNA外，其余生物的遗传物质是双链DNA不同微生物基因组差别极大5、基因水平基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。6、密码子水平遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序每一密码子由3个核苷酸序列即1个三联体组成。7、核苷酸水平是一个最低突变单位。绝大多数生物的DNA由腺苷酸、胸苷酸、鸟苷酸和胞苷酸组成。三、原核生物的质粒

1.定义：

质粒（plasmid）：凡游离于原核生物核基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA，就是典型的质粒。2、结构特点通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；3.质粒的性质①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；附加体(episome)：某些质粒具有与核染色体整合、脱离的功能，这类质粒称附加体。②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种。3、质粒的类型严紧型质粒(stringentplasmid)：与核染色体的同步复制，这类细胞中仅含1—2个质粒。松弛型质粒(relaxedplasmid)：与核染色体的不同步复制，这类细胞中含10—15甚至更多个质粒。4、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选E.coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体5、质粒的分离与检定提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；几种代表性质粒1.F质粒（fertilityfactor）：又称F因子、致育因子或性因子。是E.coli等细菌决定性别并有转移能力的质粒。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。2.R质粒（resistencefactor）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），大肠杆菌素是由Col质粒编码。3.Col质粒（colicinogenicfactor）Col质粒:能编码大肠菌素基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素影响。许多细菌都能产生抑制或杀死其他近缘细菌或者同种不同菌株的代谢产物，所以称为细菌素。即诱癌质粒。

引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子，其宿主是一种根癌土壤杆菌，是当前植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。

4.Ti质粒（tumorinducingplasmid）

存在于发根土壤杆菌中，引起许多双子叶植物患毛根瘤。可作为外源基因的良好载体和合成次生代谢产物。5.Ri质粒是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。6.mega质粒（巨大质粒）降解性质粒：这类质粒可为降解一系列复杂有机物的酶编码，可在污水处理、环境保护等方面发挥特有的作用。含有数种降解性质粒的菌株“超级菌”7.降解性质粒第二节基因突变和诱变育种一、基因突变

是变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒类）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。野生型（wildtype）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株突变体（mutant）：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株（一）基因突变的类型按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。条件致死突变型——某菌株在基因突变后，在某种条件下可正常生长、繁殖，而在另一种条件下却无法生长、繁殖。Ts突变株即温度敏感株：是一类典型的条件致死突变型。例如大肠杆菌的某些菌株在37℃以下正常生长，却不能42℃以下正常生长形态突变型—基因突变后引起的个体或菌落形态发生变异。抗原突变型——基因突变后引起细胞抗原结构发生变异。产量突变型——基因突变后引起代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。

选择性突变株非选择性突变定义：某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率：可采用营养缺陷型的回复突变株或抗药性突变株来检测。例如：突变率为10-8：一亿次分裂中，会发生一次突变。（二）突变率若干细菌某一性状的自发突变率菌名 突变性状 突变率E.coli 抗T1噬菌体 3×10–8E.coli 抗T3噬菌体 1×10–7

E.coli 不发酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外线 1×10–5Staphylococcusaureus 抗青霉素 1×10–7

（1）自发性：指可自发地产生突变（2）不对应性：突变性状与引起突变的原因之间无直接对应关系（3）稀有性：自发突变的几率很低，在10-6~10-9间（4）独立性：某基因的突变率不受它种基因突变率的影响（5）可诱变性：通过物理或化学因子的处理，可大大提高突变率（6）稳定性：突变后的新性状是可遗传的，稳定的（7）可逆性：野生型菌株发生突变后，也能发生回复突变。（三）突变的特点（四）基因突变的自发性和不对应性的证明

在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！如何证明基因突变的自发性和不对应性?三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验实验证据变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaS.E.卢瑞亚

MaxDelbruckM.戴尔布鲁克

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969变量实验（fluctuationanalysis）Newcombe的涂布实验(1949)

影印实验(replicaplating)JoshuaLederbergandEstherLederberg(1952)JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为点突变（一对碱基）和畸变（一段染色体）。具体类型可归纳如下：（五）基因突变及其机制1.诱发突变诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制。（1）碱基的置换碱基置换是染色体的微小损伤，只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分转换和颠换。诱变的机制：直接与核酸的碱基发生化学反应，引起DNA复制时发生转换；有的是碱基类似物，通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中引起转换。常见诱变剂：亚硝酸、各种烷化剂（直接作用）；5-溴尿嘧啶（2）移码突变指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。能引起移码突变都是一些吖啶类化合物突变机制：吖啶类化合物的结构与嘌呤-嘧啶对十分相似，能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间。（3）染色体畸变主要是指DNA分子的大损伤，包括缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。转座：DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座因子：又称可移动基因，或跳跃基因，指具有转座作用的一段DNA序列。定义：指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。自发突变的原因：（1）背景辐射和环境因素；（2）自身有害代谢产物；（3）DNA复制过程中碱基配对错误引起。2、自发突变紫外线对DNA的损伤机制是使相邻嘧啶形成嘧啶二聚体和水合物，相邻嘧啶形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等。样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm。照射时，要用磁力搅拌器搅拌。（六）紫外线（UV）对DNA的损伤及其修复把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现明显降低其死亡率的现象，即光复活作用。机制：经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会与一种光激活酶——光解酶结合，这种复合物在可见光下，光解酶会获得光能而激活，并使二聚体重新分解成单体。指导意义：在利用UV进行诱变育种时，要在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。1、光复活作用又称暗修复，是一种用于对被UV等诱变剂损伤后的修复方式，其特点是不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。核酸内切酶：作用位点在多核苷酸链的内部，打开一个3’-OH和5’-P的单链缺口。核酸外切酶：作用位点从多核苷酸链的5’-P至3’-OH方向切除二聚体。共需要四种酶：核酸内切酶、核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶2、切除修复微生物育种所经历的大致历程：从生产中选育或定向培育选育（未采用诱变剂，自发突变株）——采用诱变剂进行诱变，提高突变频率，筛选有用菌株——利用接合、原生质体融合等技术使基因发生重组（细胞水平）——体外DNA重组技术（基因工程技术）创造具有新的生物性状的生物二、突变与育种微生物育种的目的是人为地使某种代谢产物过量积累，最大程度降低成本，把生物合成的途径朝人们所希望的方向引导，最终获得高产、优质和低耗的菌种。（一）自发突变及育种

主要是通过实践经验选择生产中发生自发突变的菌株或不断转接微生物菌株以期获得其自发突变菌株。特点：费时、费力，工作被动，守株待兔式的例：卡介苗的筛选，连续接种230代定义：指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节2、诱变育种的原则诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子烷化剂碱基类似物吖啶化合物（1）使用简便有效的诱变剂Ames试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用

有些化学物质会引起核酸结构的损伤并对生物具有致突变、致畸变和致癌变，常简称三致作用。美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变艾姆氏试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。菌种：鼠伤寒沙门氏菌his-；原理：his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，出发菌株：就是用于育种的原始菌株。目前这项工作还仅凭经验（2）挑选优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬液：如霉菌或放线菌的分生孢子或细菌的芽孢（4）选用合适的诱变剂量紫外线剂量：强度与作用时间之乘积化学诱变剂剂量：浓度与处理时间来表示（5）充分利用复合处理的协同效应（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效筛选方案（8）创造新型筛选方法3、三类突变株的筛选（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选异烟肼是一种抗代谢药物，能阻止敏感菌的生长，而吡哆醇是异烟肼的结构类似物，当敏感菌能在含异烟肼的培养基上生长时，能合成更高浓度的吡哆醇，克服了异烟肼的竞争性抑制，所以用梯度平板法可以筛选到高产吡哆醇的突变株。涂上诱变后的酵母菌基本培养基：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基。MM完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。CM补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷突变株生长需要的组合或半组合培养基。SM野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。遗传型表示法是[A+B+]营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。A营养缺陷型用[A-B+]表示，B营养缺陷型用[A+B-]表示原养型：一般指营养缺陷型突变经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。遗传型均用[A+B+]表示（3）营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选方法（见书P222）诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）青霉素——细菌制霉菌素——真菌（菌丝过滤法）——丝状真菌和放线菌夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法a夹层培养法（3）营养缺陷型的筛选方法基本培养基——野生型完全培养基——营养缺陷型上、下两层基本培养基的作用是使菌落夹在中间，以免细菌移动或被完全培养基冲散。B限量补充培养法c逐个检出法d影印平板法满足营养缺陷型满足野生型基因重组：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，称为基因重组。一、原核生物的基因重组（一）转化受体菌直接吸收了供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。第三节基因重组和杂交