第七章原核基因的表达调控

第七章基因的表达与调控（上）组成型、永久型（constitutive）蛋白质蛋白质并不是以相同拷贝数存在于每个细胞中，有些蛋白质的数目相当固定，如糖酵解酶体系、DNA聚合酶、RNA聚合酶等。适应型、调节型（adaptiveorregulated）蛋白质合成速率明显受环境影响的蛋白质。7.1原核基因表达调控总论基因表达（geneexpression）是指从DNA到蛋白质或功能RNA的过程。对这个过程的调节就称为基因表达调控（generegulationorgenecontrol）基因表达调控水平转录水平上的调控（transcriptionalregulation）转录后水平上的调控（post-transcriptionalregulation）

♪mRNA加工成熟水平上的调控♪翻译水平上的调控原核基因调控分类负转录调控负控诱导——阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；负控阻遏——阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。正转录调控正控诱导——效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；正控阻遏——效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。大肠杆菌中的б因子（以б70为例）主要包括四个结构域σ70（上）和σ54（下）因子识别并结合在所调控基因上游的不同区域7.2.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。FrancisJacob

JacquesMonod

7.2乳糖操纵子1951年，Monod与Jacob合作，发现两对基因：Z基因：与合成β-半乳糖苷酶有关；I基因：决定细胞对诱导物的反应。Szilard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。Jacob：结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß-半乳糖苷酶操作位点乳糖操纵子结构调节基因操纵子是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，启动子，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元结构基因：产生mRNA,合成蛋白质操纵位点operator：阻遏蛋白结合位点调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）

→结构基因不转录

诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合

→结构基因转录ControlelementStructuralgenes7.2.2Lac体系受调控的证据：酶的诱导现象β-半乳糖苷酶分解底物的酶只有在底物存在时才出现！无乳糖时，几个β-gal/cell加入乳糖时，105个再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激发lacmRNA的合成

乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？培养基（35S-aa,无乳糖）→E.coli繁殖→培养基（无35S-aa,加入乳糖）→β-gal(无35S)gratuitousinducer

安慰诱导物

义务诱导物可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物IPTG，异丙基半乳糖苷TMG，巯甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖7.2.3操纵子模型（负控诱导）1调控区结构lacI,1040bp，独立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA阻遏状态诱导状态诱导物2.两个矛盾生成lac诱导物乳糖代谢Allolctose异构乳糖别乳糖细胞内β-半乳糖苷酶来源?细胞内透过酶来源?3大肠杆菌对乳糖的反应E.coli+乳糖本底水平表达的透过酶进入细胞β-半乳糖苷酶异构乳糖与阻遏蛋白结合

释放操纵区，lac基因转录β-半乳糖苷酶透过酶β-半乳糖苷酶更多乳糖分子进入细胞葡萄糖+半乳糖得到碳源和能量一部分4阻遏蛋白的作用机制阻遏蛋白结构38KD，4聚体，一个亚基结合一个IPTG分子lacI

组成型转录

Pi弱启动子，

5－10个／cell具有二重性阻止转录（与lacO结合）

开始转录（与诱导物结合）

阻遏蛋白的结构域N端1～59aa,头部片段HTH，与操纵基因DNA的大沟结合；核心区：有6个

折叠，诱导物结合在两个核心区之间的裂缝中；

C端为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。诱导物的结合可导致阻遏蛋白产生重要的构象改变，两个分子的诱导物和四聚体阻遏蛋白相结合就足以使诱导物释放。阻遏蛋白对RNApol功能的影响阻遏蛋白和RNApol可同时与DNA结合RNApol与启动子结合的平衡常数1.9X107有阻遏蛋白时,2.5X109结合着的RNApol不能转录.但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型启动子复合物.阻遏蛋白实际上使RNApol贮存在启动子上。+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded7.2.4lacoperon的正调控

1葡萄糖对lac操纵子的影响实验，在lac＋Glu培养基上E.coli只利用G，只有G耗尽时，才会利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的转录：

可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与CAP,cataboliteactivatorprotein由crp编码，代谢物激活蛋白CRP,catabolitereceptorproteinGlu↘，cAMP↗；Glu↗,cAMP↘cAMP的浓度受葡萄糖代谢的影响糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。腺苷酸环化酶基因和crp突变体不能合成lacmRNAcAMP-CAP复合物2CRP结合位点CRP为二聚体，45KD，被cAMP激活结合位点～22bpI-70~-50II-50~-40

3CRP的结合对DNA构型的影响DNA弯曲弯曲点位于CRP结合位点二重对称的中心弯曲使CRP能与启动子上的RNApol接触（1）CRP结合位点与转录起始点的位置CRP与转录起始点的距离，相距数个双螺旋，结合位点在启动子的上游.4

CRP对转录的影响（2）基因转录对cAMP—CRP系统存在依赖性

cAMP-CRP复合物的结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成开放型启动子-RNA聚合酶复合物。CRP直接作用于RNApol

α亚基缺失RNApol

α

亚基的—C末端时，失去受CRP激活的能力7.2.5lacoperon的其它问题1.lacoperon的功能是在正负两个调控体系的协调作用(coordinateregulation)下实现的。阻遏蛋白封闭转录时，CRP不发挥作用；如没有CRP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性CRP组成型合成，所以cAMP－CRP复合物取决于cAMP含量腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此cAMP－CAP调控乳糖、半乳糖等糖类代谢有关的酶

2.A基因及其生理功能编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒.所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3.lac基因产物数量，1：0.5：0.2不同酶的数量差异，是由于在翻译水平上的调节。方式有二:核糖体脱离:多顺反子的差别性翻译

内切酶作用:在lacmRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用Summary7.3Trpoperon生物细胞中的氨基酸合成，也受操纵元的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162结构基因7.3.1基因组成7.3.2Trpoperon的阻遏系统1TrpR四聚体阻遏蛋白＋trp→有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不转录2阻遏蛋白的结合位点

trpO-21~+1，反向重复序列trpP-40~+18活性阻遏物与trpO的结合与RNApol与启动子的结合发生竞争3阻遏系统主管转录是否启动，在缺乏TrpR时，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录

粗调开关7.3.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰减子，α前导RNA，140bpα弱化子，衰减子，α序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构Terminator

S3122前导肽14aa3转录弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNA

Ribosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyond

HightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)弱化子对转录调控的关键空间结构，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)时间，核糖体停顿在2个Trp密码子上时，4区未转录出来Trp浓度高时，4区转录之前核糖体到达2区。summaryNegative—repressibleoperon可以被最终合成产物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+为什么需要阻遏体系？当大量Trp存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。

经济为什么需要弱化子系统？7.4其他操纵子7.4.1半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子（galactoseoperon）在大肠杆菌遗传图上位于17分钟处，包括3个结构基因：异构酶（UDP-galactose-4-epimerase，galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galactosetransferase，galT），半乳糖激酶（galactosekinase，galK），使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操纵子的调节基因是galR，位于遗传图上55分钟处。与lac操纵子所不同的是，galR与galE、T、K及操纵区O等的距离都很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。在galR-和galOc突变体中，E、T、K基因得到永久性表达，gal操纵子的诱导物主要是半乳糖。gal操纵子有两个特点：①它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；②它有两个O区，一个在P区上游-67～-73，另一个在结构基因galE内部。1、cAMP-CRP对gal启动子的作用有些细胞株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达），在另一类细胞株中，没有葡萄糖，gal基因不表达。在gal操纵子P-O区有两个相距仅为5bp的启动子，gal操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在无葡萄糖时才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CRP和较高浓度的cAMP。当腺苷环化酶突变（cya-）或cAMP受体蛋白突变（crp-）时，gal操纵子不能从S1起始转录。当有cAMP-CRP时，转录从S1开始；当无cAMP-CRP时，转录从S2开始。2、双启动子的生理功能为什么gal操纵子需要两个转录起始位点呢？因为半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质——尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体，细胞必须随时合成差向异构酶，以保证尿苷二磷酸的供应。在没有外源半乳糖的情况下，细胞通过半乳糖差向异构酶（galactoseepimerase，galE基因产物）的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。如果只有S1一个启动子，由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。如果S2是唯一的启动子，那么，即使有葡萄糖存在，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，能量被浪费。7.4.2阿拉伯糖操纵子araB、araA和araD基因参与阿拉伯糖的降解，它们是一个基因簇，简写为araBAD。araB基因编码核酮糖激酶，araA编码L-阿拉伯糖异构酶，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶。araE和araF负责将阿拉伯糖运入细胞内。它们位于远离这个基因簇的地方，分别编码一个膜蛋白和一个位于细胞壁与细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。启动子区域，与araBAD相邻两个操纵区（O1，O2）调节基因araC。cAMP-CRP是正调节因子，AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。Ara操纵子的结构ara操纵子上游调控区序列与功能分析ara操纵子是可诱导的。诱导物是阿拉伯糖，cAMP-CRP起正调控作用。AraC蛋白具有PBAD活性正、负调节因子的双重功能。Pr是起阻遏作用的形式，可与类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。a.没有AraC蛋白时，由Pc启动子起始araC基因转录；b.葡萄糖水平较高时，AraC蛋白与操纵区O2以及araI上半区相结合，形成DNA回转结构，araBAD基因不表达；c.有阿拉伯糖但无葡萄糖存在时，AraC与阿拉伯糖相结合，变构成为激活蛋白，与araO1和araI区相结合，在CRP-cAMP的共同作用下起始结构基因表达。a.培养基含有葡萄糖，无阿拉伯糖时，cAMP-CRP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与操纵区O2位点结合，RNA聚合酶不能与Pc结合，araC基因受到抑制，整个系统几乎处于静止状态。b.没有葡萄糖糖，也没有阿拉伯糖。因为没有诱导物，尽管有cAMP-CRP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区O2位点相结合，无araBADmRNA转录。c.无葡萄糖，有阿拉伯糖。大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区O1

、I位点相结合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。7.4.3阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答当细菌DNA遭到破坏时，细胞内会启动一个被称为SOS的诱导型DNA修复系统。参与SOSDNA修复系统的基因都受LexA阻遏蛋白的抑制，SOS体系的诱导表达过程中LexA阻遏蛋白被移开。一般情况下，约有1000个RecA蛋白单体分散在每个细胞中。当DNA严重受损时，单链DNA缺口数量增加，RecA与这些缺口处单链DNA相结合，被激活成为蛋白酶，将LexA蛋白切割成没有阻遏和操纵区DNA结合活性的两个片段，导致SOS体系（包括recA基因）高效表达，DNA得到修复。大肠杆菌中受LexA蛋白阻遏的SOSDNA损伤修复系统操纵子的表达调控模式7.4.4二组分调控系统和信号转导最简单的细胞信号系统称为二组分系统（two-componentsystems），由二种不同的蛋白质组成：即位于细胞质膜上的传感蛋白（sensorprotein）及位于细胞质中的应答调节蛋白（responseregulatorprotein）。细菌中参与信号转导的二组分调控系统7.4.5多启动子调控的操纵子1、rRNA操纵子rRNA操纵子（rrnE）有两个启动子P1和P2。其中，P1为强启动子。当细菌处于紧急状态，细胞中ppGpp浓度增加，P1的作用被抑制。为维持细菌最低能量需求，由P2起始rrnE基因转录。魔斑核苷酸魔斑核苷酸为ppGpp或pppGpp，因其能在色谱上检测出斑点而被称为魔斑氨基酸缺乏时，空载tRNA进入A位点。A位点积聚的GTP进入另一反应途径：

GTP+ATP→pppGpp+AMP→ppGpp2、核糖体蛋白S1操纵子核糖体蛋白SI操纵子——rpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成S1蛋白。P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，P1、P2启动子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的S1蛋白维持了生命的最低需要。3、DnaQ蛋白操纵子DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亚基。其操纵子有两个启动子，P1为强启动子，P2为弱启动子。增殖速度慢时，在细胞中RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录由弱启动子P2控制；而RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1。7.5固氮基因调控氮是所有生物的基本组成成分，蛋白质、核酸及许多小分子代谢产物都是含氮化合物；直接利用氮源的只有少数原核生物；

根瘤菌的固氮作用。7.5.1根瘤的产生根瘤菌在豆科植物根际的生长以及与寄主植物根毛幼嫩部位的接触是感染发生的第一步。通常情况下，根瘤菌特定小种的寄主范围都是很狭窄的，如Rhizobium

trifolii主要感染三叶草，R.phaseoli主要感染菜豆，R.Leguminosarum主要感染豌豆。7.5.2固氮酶N2+8H++32ATP→2NH3+H2+32ADP+32Pi固氮酶组分I和III由两个5.0×104的α亚基和两个6.0×104的β亚基组成，由nifD和nifK基因编码。含有4个[4Fe-4S]连接桥和两个铁-钼辅助因子（Fe