第七章 杂交育种

第七章杂交育种10/24/20231第一节杂交育种概述第二节常规杂交育种第三节原生质体融合育种主要内容10/24/20232第一节杂交育种概述10/24/20233杂交育种(hybridization)：指通过基因重组的方法获得新基因型的一项育种技术。杂交的目的：使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种。

杂交育种:10/24/202341.可以获得新品种。可以提高菌株性能，避免诱变饱和现象。3.可以总结遗传规律，促进遗传学理论发展。杂交育种的意义10/24/20235原核生物(细菌和放线菌)杂交过程:两个亲本菌株的染色体发生部分转移，形成部分结合子(merozygote)，最后经交换、重组直致重组体产生。真菌杂交过程：通过有性生殖(sexualreproduction)或准性生殖(Parasexualreproduction)来完成。一、微生物杂交理论基础10/24/20236原核微生物杂交方式：接合(conjugation)

转化(transformation)

转导(transduction)（一）原核微生物杂交理论基础10/24/20237接合(conjugation)接合：指供体菌（“♂”）通过性菌毛与受体菌（“♀”）直接接触，通过F因子转移遗传物质的重组过程。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为接合子（conjugant）。E.coli接合电镜图♂♀性菌毛10/24/2023810/24/20239F-×F+F+F++F-×+F'F'F'×+F-HfrHfrF-（多数情况下）F-×+HfrHfrHfr（少数情况下）含F质粒菌株杂交结果10/24/20231010/24/202311（二）真核微生物杂交理论基础真核微生物杂交方式：有性杂交、准性杂交和原生质体融合等。1.有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可通过与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。10/24/2023122.准性杂交(parasexualhybridization)准性生殖是一种类似于有性生殖，但更为原始的生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而发生低频率基因重组并产生重组子。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。10/24/20231310/24/202314二、微生物杂交育种基本程序选择原始亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定直接亲本杂交分离与筛选重组体重组体分析鉴定10/24/20231510/24/2023161.原始亲本菌株的选择①原始亲本：微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株。②选择：主要根据杂交目的。选择产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本。它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分离的野生型菌株。③标记特征：原始亲本还应该具有野生型遗传标记，如抗性标记等性状。杂交育种中亲本和培养基的选择10/24/2023172.直接亲本的选择①直接亲本：在杂交育种中由原始亲本经诱变剂处理后选出的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株。②要求：a.各自的性状优良、突出，经过重组后产生杂种优势；b.最好采用具有明显遗传性状差异的近亲菌株为直接亲本。10/24/2023183.培养基常用的培养基:完全培养基(CM)、基本培养基(MM)、补充培养基(SM)和有限培养基(Limitedmedium，LM)。有限培养基：是专供异核体菌株生长使用的培养基。通常在基本培养基或蒸馏水中加入适量(10％-20％)的完全培养基，加入的量只限两直接亲本菌株稍许生长，以提供相互接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多，会影响异核体菌株的检出。10/24/202319一般杂交亲本用营养缺陷型或抗药性突变型等遗传标记，作为选择重组体的标准和依据。此外，还要利用亲本菌株本身具有的某些特殊遗传性状作为辅助标记，如温度敏感性、孢子颜色、代谢产物产量高低等。杂交育种的遗传标记10/24/202320（一）常规杂交育种细菌、放线菌:接合(conjugation)、转化(transfor-mation)、转导(transduction)等技术。真菌:有性生殖、准性生殖三、杂交育种方法（二）原生质体融合(protoplastfusion)育种通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲合力限制，甚至可打破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体，这种特殊的杂交方式称为原生质体融合育种。10/24/202321第二节常规杂交育种

（放线菌杂交育种）10/24/202322放线菌杂交育种1955年在天蓝色链霉菌中最早发现。放线菌的遗传结构与细菌相似，所以基因重组过程类似于细菌。通过供体菌向受体菌转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。但放线菌的细胞形态和生长习性与霉菌很相似，具有较复杂的形态分化，生长过程中产生菌丝体和分生孢子，所以育种操作方法与霉菌基本相同。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。10/24/202323一、放线菌杂交原理10/24/2023241．接合由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，在双方细胞增殖过程中两个遗传类型不一致的细胞核的部分染色体进行转移和遗传信息交换，形成部分结合子。二、放线菌杂交过程10/24/202325

部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。ab10/24/2023262．杂合系和重组杂合系形成部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系，交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状，并且在染色体末端具有串连的重复体。这种重复结构，有的成为一个二体区，有的是两个二体区。10/24/2023272．杂合系和重组杂合系形成在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为杂合状态，产生了各种不同基因型的重组杂合系。10/24/2023283．重组体以上产生的杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。杂合系是形成重组体所必须的阶段。10/24/202329放线菌杂交技术：混合培养法玻璃纸法平板杂交法三、放线菌杂交技术10/24/202330混合培养法1选择原始亲本2斜面混合接种5杂合系分析4检出重组体3制备单孢子悬液10/24/202331P平板杂交法10/24/202332第三节原生质体融合育种10/24/202333一、原生质体育种与原生质体融合育种1953年，weibull等首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌细胞获得原生质体，并首先提出原生质体概念。1955年，Mcquillen首次发现巨大芽孢杆菌原生质体的再生方法，使之恢复成正常细胞并能继续生长繁殖。20th70s以来，各种原生质体操作技术已成为工业微生物育种的重要手段，并取得了较大成就。

细胞壁被酶水解剥离，剩下由原生质膜包围着的原生质部分成为原生质体。10/24/202334原生质体再生育种原生质体诱变育种原生质体转化育种原生质体融合育种…常见原生质体育种方法：10/24/202335

原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。原生质体再生育种不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正变率。原生质体再生育种10/24/202336是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。1983年，Kim等首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌(Micromonosporarosaria)取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素、酶制剂、有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。原生质体诱变育种10/24/202337原生质体转化育种是将整条染色体DNA或片断DNA或质粒DNA转化原生质体的技术，转化育种为实现定向育种的目标和原生质体育种技术开拓了一个更广阔的领域。一般来说，用染色体DNA或其他线状DNA转化原生质体效率较低，而用质粒DNA能得到高频转化率，完整质粒、单链质粒和重组质粒都能成功地转化。

10/24/202338原生质体融合育种用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。10/24/202339研究表明，由聚乙二醇(PEG)诱导的原生质体融合是微生物获得高频重组的主要方法，种内的融合频率可高达27％，种间的融合频率也可达10％，比常规的杂交重组频率提高数千倍以上。最近出现的电场诱导融合又将融合率提高10倍。10/24/202340原生质体融合育种的优缺点：

第一，大幅度提高亲本之间重组频率。不少链霉菌通过原生质体融合，其后代的重组率达1％左右，比准性重组率高20－20000倍。如果融合前结合紫外线处理，重组频率可达20％－30％。10/24/202341第二，扩大重组的亲本范围。常规杂交的亲本间必须具有感受态，有些菌株由于其表面结构缘故而无法用常规方法进行杂交重组。原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，因此，实现常规杂交无法做到的种间、属间、门间等远缘杂交。10/24/202342第三，原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组较多，集中双亲本优良性状机会更大。第四，与常规诱变育种途径相比，还具有定向育种的特点。10/24/202343不足之处：①原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度。②细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使远缘融合杂交存在较大困难。10/24/202344原理：原生质体融合本质是二亲本菌株去除细胞壁后的一种体细胞杂交育种方法。两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶去除细胞壁后，在促融剂诱导作用下，两个裸露的原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组目的，最后对重组体进行生产性能、生理生化和遗传特性分析。二、原生质体融合育种的原理

10/24/202345三、原生质体融合育种的步骤一）直接亲本及其遗传标记选择二）双亲本原生质体制备与再生三）亲本原生质体诱导融合四）融合重组体(称为融合子)分离五）遗传特性分析与测定六）生产性能筛选10/24/202346一）直接亲本及其遗传标记的选择

从育种角度，一般把诱变系谱中筛选获得的不同“正突变株”作为直接亲本进行融合，通过交换、重组，使优良性状集中于重组体中，以加快育种速度。现在一般认为原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。10/24/202347遗传标记除常用的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死(灭活)、孢子颜色和菌落形态等作为标记。1.如果目的是为了进行遗传分析，应该采用带隐性基因的营养缺陷型菌株或抗性菌株。2.如果从育种角度进行原生质体融合，由于多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量(尤其对一些抗生素产生菌)，选择营养标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的营养缺陷型。10/24/2023483.采用灭活标记。把双亲中任何一方的原生质体用热灭活(如50℃2h或60℃5min)或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者为供体，后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传标记。采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。10/24/202349二）原生质体制备与再生

1原生质体制备活性原生质体制备过程包括原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。细胞去壁后，原生质体从中释放出来，此过程为原生质体分离。

去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法。10/24/202350酶法分离原生质体：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸法或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下酶解细胞壁。注意：不同的微生物选择不同的酶。细菌、放线菌：溶菌酶真菌：蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶10/24/202351酶法分离原生质体的影响因素

(1)培养基组成

(2)菌体培养方式

(3)菌体菌龄

(4)稳定剂

(5)酶解前的预处理

(6)酶系和酶的浓度

(7)酶的作用温度和作用pH值

(8)菌体密度

(9)酶解方式

10/24/2023522．原生质体的观察

水解酶作用于菌体后，必须定时取样观察原生质体分离的程度，以确定酶解终点。(1)低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。细胞壁去除完全的原生质体吸水破裂后细胞彻底解体，没有残骸；如果原生质体破壁不完全，还有部分剩余细胞壁，则原生质体从无细胞壁处吸水，膨胀破裂并留下一个残存的细胞形态；对于那些正常细胞或酶解程度不彻底的细胞，吸水后由于细胞壁的保护作用，不会胀裂，能维持正常形态。10/24/202353(2)荧光染色法：原生质体混悬液用0.05％－0.1％的荧光增白剂(VBL)染色，离心弃染料、洗涤后在荧光显微镜下观察(波长用360－440nm)，如发出红色光则为完全原生质体，如发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。10/24/2023543．原生质体的收集和纯化

(1)过滤法：适用于丝状微生物(如放线菌、霉菌及丝状微藻等)，根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤。原生质体由于外层细胞膜柔软可变形，可以由比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团却不能，由此原生质体和正常细胞分离而得到纯化。对一些细胞较大的微生物(如微藻)，也可采用微孔径网筛来过滤原生质体。10/24/202355(4)漂浮法：适用于一些细胞较大的微生物，原生质体的比重小于细胞，能在一定渗透浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。(3)界面法：将原生质体分离液置于两种液体的混悬液中，这两种液体密度有区别，上层密度小于下层密度，离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。(2)密度梯度离心法：用蔗糖或氯化铯等制成浓度梯度溶液，由于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。10/24/2023564．原生质体的活力鉴定

染色鉴定法：

荧光素双醋酸酯(FDA)染色法，FDA本身不发荧光，被细胞吸收酯解后产生具有荧光的极性物质。荧光物质不能透过质膜，存在于活细胞内，这样就可通过观察原生质体是否发生荧光来判断其活性有无，能发出荧光的原生质体具有活性。

10/24/2023575原生质体的保存

低温下保存：在一般冷藏条件下保存时间很短，有些种类几小时就失活。在液氮中超低温状态下保存时间可长些。方法是加入5％的二甲亚砜(DMS)或甘油等其他保护剂，迅速降温保藏。

10/24/2023586原生质体再生原生质体具有细胞全能性，但本身不能立即进行分裂、增殖，必须首先重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的再生。过程大致分为三个阶段：①大分子合成与原生质体生长，这一时期原生质体主要是合成细胞器成分，表现为原生质体的体积增大；②细胞壁合成与再生，此时期主要合成细胞壁物质，组装、恢复成完整细胞；③分裂能力恢复并开始分裂繁殖成为正常的细胞形态和菌落。

10/24/202359⑴原生质体再生的影响因素

①菌体生理状态②稳定剂

细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液，如放线菌常用10％－15％蔗糖溶液；霉菌常用盐溶液系统，如NaCl、KCl、MgSO4等组成的稳定液，浓度为0.3-1.0mo1/L；③酶浓度和酶作用时间10/24/202360④再生培养基组成⑤残存菌体的分离⑥原生质体密度⑦排除再生培养基上的冷凝水10/24/202361（2）再生方法一般采用双层平板法：其下层为再生培养基，琼脂含量约2％，制成平板后除去冷凝水，取原生质体悬浮液0.1ml加到平板上，然后上层加入含0.8％琼脂或0