香蕉穿孔线虫双重pcr扩增的研究

香蕉穿孔线虫双重pcr扩增的研究

香蕉腐烂线是一种广泛的内寄生虫线，其寄生范围非常广泛。报告的样本数超过350种。主要危害香蕉、柑橘、可可树、棕榈树、生姜、茶树、鄂梨、咖啡、胡椒、甘蔗、花生、胡萝卜、番茄、马铃薯、西瓜、番荔枝等多种农作物和园艺植物,是热带地区果树上最重要的线虫之一。由于香蕉穿孔线虫经济意义极大,多数区域国际植物保护组织和国家将其列为检疫线虫,也是我国的一类植物检疫性有害生物。该线虫主要危害寄主植物的根部,在世界范围内大多通过植物种苗根以及附带的土进行远距离传播。自1999年报道从进口的大巴榕水草上发现香蕉穿孔线虫以来,又多次在进口的火鹤、生姜、凤梨、水草,甚至椰糠介质土中截获香蕉穿孔线虫。鉴于此,随着我国对外开放的不断深入,进口花卉等园艺植物的不断增加,香蕉穿孔线虫对我国农林生产安全的威胁日益加剧。不同的区域、不同的生态条件和不同寄主上的香蕉穿孔线虫其形态特征有差异,如尾部形态、交合伞的长度等变异较大,同时发现在一些进境寄主植物中虫量很低。因此,对该线虫进行准确的形态鉴定存在诸多困难,并且也需要花费较长的时间。所以,在口岸一线加强对该线虫进行检测,研究香蕉穿孔线虫的分子快速检测技术尤为重要。已有许多报道用分子和生化方法进行区分香蕉穿孔线虫,如RFLP、同工酶、RAPD、PCR等,但主要是进行系统进化分析,揭示种间、种内差异。最近周春娜等(2006)也报道设计1对特异引物进行香蕉穿孔线虫的鉴定。作者设计2对特异引物对香蕉穿孔线虫不同种群进行双重PCR检测,引物以香蕉线虫各种群的保守区作为靶标,同时对香蕉穿孔线虫具有专化性,能准确地对其进行分子鉴定。1材料和方法1.1截短丝片及短体线虫群体供试的香蕉穿孔线虫分别为上海局和深圳局在口岸检疫中截获的群体;咖啡短体线虫和穿刺短体线虫是广东局和云南局在口岸检疫中截获的;潜根线虫来自云南省(表1)。1.2线虫的消毒和接种将上述短体科线虫群体在胡萝卜片上进行培养,参照Koshy等的方法并进行了改良。具体方法如下:将新鲜胡萝卜洗净,用95%酒精表面消毒,切成厚度为1cm左右的胡萝卜片,再用灭菌的解剖刀去皮,最后用镊子将胡萝卜片放入1%水琼脂培养基中,于25℃下培养愈伤组织后待用。线虫的消毒方法如下:将线虫挑到消毒液(0.0002%放线菌酮和0.1%硫酸链霉素)中,4℃过夜;把消毒后的线虫用无菌水洗涤2～3次,接种到长好愈伤组织的上述胡萝卜片上,于25℃培养箱中培养。培养后的线虫用改良的贝尔曼漏斗法分离。1.3模型准备线虫群体种群基因组DNA用单条线虫提取;根据Zheng等线虫提取方法。大量线虫基因组提取用苯酚-异戊醇抽提法。1.4香蕉穿线虫序列及保守序列的设置从GenBank下载已发表的香蕉穿孔线虫不同群体的序列,穿孔属其它线虫种以及短体线虫序列,用CLUSTUL1.8.1软件进行序列对比,然后选择香蕉穿孔线虫各群体的保守序列,用PrimerExpress软件设计引物,并将引物序列用GenBank进行BLAST评估。引物由上海生工合成。1.5测试系统测试1.5.1pcr扩增过程dna的制备用2对引物分别对供试线虫群体进行测试。25μL体系内含2.5μL10×PCR反应缓冲液;1μLMgCl2(25mmol/L);1μLdNTP(2.5mmol/L);1μL上游引物(10μmol/L);1μL下游引物(10μmol/L);4.0μL模板DNA;0.2μLTaqMan聚合酶(5U/μL),最终用水补足25μL。所用的反应程序为95℃预变性3min,接着95℃15s,51.4℃25s,72℃30s,40个循环后,72℃延伸5min。用2%琼脂糖电泳,6×Loadingbuffer上样,100V50min,凝胶成像仪拍照。以不加模板DNA的反应作为对照。将PCR产物送上海生工进行双向测序。用2对引物进行双重PCR扩增的反应体系以及反应程序基本相同。1.5.2退火温度的选择为了避免非特异片段扩增以及假阴性的出现,对双重PCR反应的退火温度进行优化。从45℃到60℃共设12个温度梯度,分别为45.0、45.5、46.3、47.5、49.2、51.4、53.9、56.0、57.7、58.8、59.7和60.0℃,以选择最佳的退火温度。同时,对反应体系中引物进行了不同的浓度配比筛选,共筛选了8个不同的浓度配比,终浓度从0.2μmol/L到1.2μmol/L,R1/2与RS1/2浓度配比分别为0.2μmol/L∶0.4μmol/L、0.2μmol/L∶0.8μmol/L、0.2μmol/L∶1.2μmol/L、0.4μmol/L∶0.4μmol/L、0.4μmol/L∶0.8μmol/L、0.8μmol/L∶0.4μmol/L、0.8μmol/L∶1.2μmol/L、1.2μmol/L∶0.8μmol/L,以选择最佳的浓度配比。1.5.3pcr扩增香蕉穿束线虫的单条线虫pcr检测工艺优化将提取的核酸用紫外分光光度计进行核酸浓度测定,再梯度稀释成不同的浓度,反应使用的模板量从1×104、1×103、100、10、1、0.1和0.01pg,共7个梯度,然后进行PCR扩增,同时,对4个不同群体的香蕉穿孔线虫的单条线虫进行扩增,扩增的条件使用优化后的条件。2结果2.1试剂的特异性试验2.1.1线虫电泳结果所设计的检测香蕉穿孔线虫双重PCR引物序列分别为R1:5′-TGGGTTGGCGTCTG-3′,R2:5′-GCATTTGTC-TTGCGTTT-3′;RS1:5′-GCTGTCATCGCCTTTG-3′,RS2:5′-GCATTTGTCTTGCGTTT-3′。检测5个不同线虫种类的电泳结果见图1。图中标记的2～10为用引物R1和R2进行扩增的结果,这对引物仅能使穿孔属线虫扩增出362bp的片段;标记的12～20为用引物RS1和RS2扩增的片段,只有香蕉穿孔线虫能扩增出291bp的片段;分别用2对引物对其它线虫的测试表明均不能进行扩增。上述扩增出362和291bp的PCR产物送上海生工进行双向测序,测序结果证明PCR产物是目的片段。2.1.2供试种群的扩增用2对引物同时进行双重PCR扩增,所有的香蕉穿孔线虫群体都能扩增出291和362bp的2条谱带,其中291bp的片段为香蕉穿孔线虫的特异片段,362bp的片段为Radopholus属的特异片段,其它供试种群均不能进行扩增(图2)。表明这对引物对香蕉穿孔线虫具有特异性,能够进行香蕉穿孔线虫鉴定。2.2延伸温度电泳结果从45℃到60℃共设12个温度梯度,对反应体系的退火温度进行优化,从45℃～56℃共有8个温度可以扩增出2条目的片段;而当延伸温度为57.7、58.8或59.7℃时,只能扩增出362bp的片段,但是电泳条带不清晰;当温度为60℃时,2条目的片段都不能进行扩增。根据延伸温度电泳的结果,最佳的延伸温度为51.4℃(图3)。在反应体系中,对引物不同浓度配比测试,8个不同的浓度配比均能进行扩增,但是,R1/2与RS1/2最佳的浓度配比为0.2μmol/L∶1.2μmol/L(图4)。2.3初始模板量对比检测体系共测试模板7个不同的起始量,能检测的最低量为100pg(图5),起始模板量低于100pg,则不能有效地进行扩增。单条线虫的检测结果表明(图6),4个不同香蕉穿孔线虫群体的单条线虫均能有效地进行扩增。3香蕉穿束中香蕉钻孔线虫的分子鉴定香蕉穿孔线虫是我国一类植物检疫性有害生物,尽管近几年我国口岸曾多次截获,但是由于不同地理来源、不同寄主,该线虫会出现形态上的差异,为口岸检疫中该线虫的形态鉴定带来了很多的困难,而分子检测技术为线虫的快速、准确鉴定提供了方便。双重PCR是指在同一PCR反应体系里加上2对引物,同时扩增出2个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相似,并已成功用于多种生物检测。尤其是Subbotin等用双重PCR成功进行大豆胞囊线虫的快速检测,能单条线虫检测,同时还能检测土壤中的大豆胞囊线虫。常规PCR一般使用1个退火温度,在双重PCR中,理论上既可使用1个退火温度,也可以使用多个退火温度或者降落PCR。在本实验中尝试选择2个退火温度以及降落PCR,但是都没有达到一个比使用1个退火温度好的结果,可能是选择的温度范围的影响,不过在本检测实验中,1个退火温度就能满足香蕉穿孔线虫的双重PCR检测。同时,循环次数、镁离子浓度、酶的浓度以及dNTP的浓度对该检测体系的影响不大,但是模板的浓度以及核酸提取质量对该检测体系有一定的影响,当提取质量低,有其它杂质影响或者核酸降解都会造成扩增不整齐。Elbadri等曾经对19个不同的香蕉穿孔线虫群体进行核糖体ITS扩增、测序,并进行RFLP分析。结果表明:核糖体ITS区的序列种内的同源性为96%,ITS1区的同源性远远高于ITS2区。用整个ITS区的片段进行RFLP分析,只有选择几种有效的酶才能进行香蕉穿孔线虫的RFLP分子诊断,但该研究技术主要是用于种群间的系统进化分析。同时,该分子鉴定技术由于电泳条带比较多,电泳时干扰因素较多,再加上不同的实验室以及不同的操作人员很难做到标准化。Kaplan等系统分析了57个不同的香蕉穿孔线虫群体的核糖体ITS序列,主要是系统分析不同地理种群以及来自不同寄主的线虫群体的差异,研究结果也表明,香蕉穿孔线虫不同群体ITS1区序列具有很高的保守性。上述研究表明,香蕉穿孔线虫的核糖体ITS1区序列适合用来进行分子鉴定,而作者设计的香蕉穿孔线虫的特异引物也设计在ITS1区,引物能对香蕉穿孔线虫群体进行很好地定性检测。1条线虫理论上所含的基因组DNA约为40ng,在实验中,用蛋白酶K提取方法提取线虫的效率最低为3%。因此,单条线虫能有效提取的DNA最低量约1.2ng,但普通PCR反应起始模板浓度一般最低为10ng才能以琼脂糖电泳以及EthidiumBromide染色的方法测得,此为普通PCR检测单条线虫效果不稳定的原因之一。但双重PCR为2对引物,灵敏度可提高10至100倍,而本研究中双重PCR能够检测的最低模板起始量为100pg,故单条线虫对双重PCR检测其核酸量已足够了。同时,作者也使用该方法对线虫侵染的生姜样品(人工接种)进行了检测,得到了很好的阳性结果,但鉴于目前样品数量的限制,并未进行大批量的检测。由于植物组织中线虫基因组DNA提取的效率受到寄主物质的影响,只有当线虫的数量达到一定量时,该检测体系才能成功运转。Murrell等提供了一种受侵染香蕉根中香蕉穿孔线虫基因组提取的方法,该方法的提取效率更高,可为植物组织中香蕉穿孔线虫的分子鉴定提供借鉴。Zhou等设计1对特异引物对香蕉穿孔线虫进行检测。本研究中的双重PCR两对引物既能检测Radopholus属,又能检测