水生动物的先天免疫

水生动物的先天免疫

动物免疫包括非特异性免疫和特定免疫。免疫学家对非特异性免疫的形成和它们与免疫系统的相互作用非常感兴趣。非特异性免疫也叫先天性免疫,是指一个生物所具有的对病原体和有害异物的基本先天抵抗和防御性。先天免疫对绝大多数的病原体和有害异物具有潜在快速、有力和非特异性免疫反应的特点。能否对疾病进行有效的先天免疫常常是宿主动物生与死的分水岭。先天免疫包括物理、生理、细胞和分子不同层次上的防御屏障。水是鱼类赖以生存的基本环境同时也是很多水生病原体传播的媒介。鱼类的体表形成了重要的第一条防线。因为鱼类时刻与水接触,身体上的保护屏障就显得极其重要,鳞片、皮肤和粘液膜的表面都是抵御病原体侵入的重要物理屏障。鱼类粘液层含有抗生素物质,能有效地在最早阶段阻止病原体的感染。先天免疫性的生理学屏障包括温度、pH、溶氧和水溶性因子。当物理屏障被突破后,侵入的病原体将面临一系列可溶性因子包括抗菌肽、蛋白酶、溶解酵素、补体因子和急相蛋白(acute-phaseproteins)。在细胞水平,宿主能通过內吞和噬菌作用摄入细胞外的大分子和粒子,与此同时,先天免疫的细胞组分在遇到病原体识别相关的分子形态(PAMPs)包括脂多糖(LPS)、双链RNA以及由宿主细胞产生的细胞因子时,即被激活。病原微生物的侵入经常引起组织的损伤,产生了所谓炎症反应(inflammatoryresponse)的一系列复杂免疫反应。在炎症反应中的关键物质包括细胞因子,即一组在免疫系统行使细胞与细胞之间信使功能的小分子量蛋白质。哺乳动物先天免疫系统趋化因子、细胞因子和补体因子等研究的逐渐深入,加快了鱼类同一领域研究步伐。鱼类在进化图谱上代表着仅具有先天免疫系统的动物和主要依赖获得性免疫动物的中间类群。因而,通过鱼类免疫系统的研究,可以获得大量的关于免疫系统的进化、功能和调节方面的信息。而且,由于鱼类是现存的脊椎动物中种类最多的类群,使得对更广阔范围的免疫适应研究成为可能。非特异性免疫对鱼类尤其重要。高密度人工养殖经常导致急性病害暴发,如斑点叉尾鮰肠道败血病(ESC)就是这种病,感染后4d就发生严重死亡。这个短暂的时间意味着特异性免疫反应(抗体产生)不可能有效地完成,鱼类只能依赖先天免疫抗性才能有效地抵抗疾病。染病后的存活者及其与先天免疫相关基因表达相互关系的研究,为鱼类免疫系统研究提供了令人振奋的基础。在此我们回顾鱼类趋化因子研究的现状,包括重要功能和表达分析以及这个领域未来研究趋势。1趋化因子基因检测作为一个趋化性细胞因子基因大家族,是先天免疫至关重要的组成部分。趋化因子的共同特点是能够刺激受感染或损伤部位细胞的补充、激活和粘附。炎症反应是可诱导的先天免疫的一个重要组成部分,往往在感染后1-2d内就可见感染症状,趋化因子是炎症反应的中间物质。趋化因子是结构上相关的多肽(Peptides),大多数含有4个保守的半胱氨酸残基(Cysteineresidues)。根据此4个保守半胱氨酸残基的排列形式不同,趋化因子基因可以分为4个基因亚族:CXC(α)、CC(β)、C(γ)和CX3C(δ)。对应于这些亚族趋化因子蛋白的编码基因,在鱼类分别命名为SCY(smallinduciblecytokines)后面加上一个字母A、B、C或D,再加上数字,如SCYA101等。在哺乳类和其它动物趋化因子多以命名为CCL、CXCL、CL和CX3CL后加上数字,如CXCL8等。目前,已有从哺乳动物分离鉴定出16个CXC、28个CC、2个C和1个CX3C趋化因子基因。CXC和CC类趋化因子是趋化因子大家族中最大的两个亚族。1.1cxc趋化因子CXC趋化因子是通过其蛋白质分子中的前两个保守半胱氨酸残基的排列形式命名的,即在前两个保守半胱氨酸残基(CC)之间夹有任何一个其它种类的氨基酸(X)。CXC趋化因子是最早鉴定的具有趋化嗜中性粒细胞能力的趋化因子。但是,它也具有趋化单核细胞和淋巴细胞的功能。已有16个CXC趋化因子(CXCL1-CXCL16)从哺乳动物分离、克隆和鉴定出来,其中的15个来自人类,13个来自鼠类。同时,只有CXCL15没有在人类中发现,CXCL7、CXCL8和CXCL16没有在鼠中发现。因为人和鼠基因组资源研究较为全面、清楚,所以,人类应该是单一种类中发现CXC趋化因子数目最多的,含有15个CXC趋化因子。人类的15个CXC趋化因子,除了CXCL12在10q11.21、CXCL14在5q31.1和CXCL16在17p13号染色体外,其它都分布在4q21.1号染色体上。根据ELR基序glutamicacid(E)、leucine(L)和arginine(R)的存在与否,CXC趋化因子可分为两个亚组。ELR亚组包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8和CXCL15。CXC趋化因子专门吸引能表达CXCR1和CXCR2的嗜中性粒细胞。它们能在很广泛的细胞中对很多刺激物做出表达反应,特别是对像细胞介素I(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)这样的前炎症细胞因子(pro-inflammatorycytokines)。主要作用是促进嗜中性粒细胞与内皮细胞(endothelialcells)的黏附以及随后的相关基质蛋白和细胞表面物质沿着趋化因子浓度梯度向炎症灶的定向移动。含有ELR基序的趋化因子都对生血管(angiogenic)和内皮细胞有趋化性。非ELR基序趋化因子包括CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14和CXCL16,它们吸引淋巴细胞和单核细胞,对嗜中性粒细胞有较弱的趋化性,它们中的大部分都具有抗血管收缩(angiostatic)和抗血管生成性质(anti-angiogenicproperties)。1.2elr和scyba的鉴定第一个鱼类CXC趋化因子是从无颌类鱼类七鳃鳗(Lampetrafluviatilis)获得的,是一个CXCL8样的蛋白肽。有趣的是,与CXCL8嗜中性粒细胞吸引能力的相关的ELR基序在七鳃鳗这个分子中并不存在。后来,七鳃鳗的所谓CXCL8在其它鱼类中也被发现,在牙鲆(Paralichthysolivaceous)中发现的一个CXCL8样趋化因子与哺乳类和鸟类CXCL8有高度序列相似性,不过在牙鲆中氨基酸序列也同样缺少ELR基序。最近,几个同源性CXCL8趋化因子分别从虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss),带鲛鲨(Triakisscyllia),银鲛(Chimaeraphantasma)、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)鉴定出来。所有鱼类的CXCL8缺少前面所讲的CXC具有的ELR基序,因此认为ELR基序的要求对于CXCL8的趋化功能可能不是严格和必需的。从鱼类中分离出了CXCL10的同源体(homologues),在虹鳟中被鉴定为与CXCL9、CXCL10和CXCL11的一个100个氨基酸的趋化因子分子却与CXCL10高度同源。近年来,一个CXCL10样的趋化因子从斑点叉尾鮰和蓝鮰鉴定出来,对鮰鱼杂交F1代的单个个体PCR扩增产物的序列分析,表明斑点叉尾鮰和蓝鮰是一个CXC趋化因子的多基因家族,CXC趋化因子在很多种组织都有表达,包括头肾、脾脏、肝脏、鳃丝、皮肤、胃和肠,但不在肌肉表达。用斑点叉尾鮰的肠道白血病(ESC)的致病菌爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)进行感染试验,实时定量RT-PCR定量分析显示CXC趋化因子表达水平显著提高,并且观察到在抵抗型和敏感型群体间的不同表达谱,即在斑点叉尾鮰的表达要远远高于在蓝鮰中的表达。从斑马鱼中得到的一个CXCL12样EST序列在氨基酸水平上与人CXCL12的同源率为44%,显示在其它发育过程具有一定作用,像控制原基细胞的移动等。研究表明斑点叉尾鮰也存在CXCL12,并且与斑马鱼的氨基酸序列具有高度同源性。CXCL14的同源体已经从斑马鱼鉴定出来,肽链中含有100个氨基酸,与哺乳动物CXCL14有52%~54%的同源性,其命名为Scyba。研究证实它的前16个氨基酸构成功能性信号肽,Scyba估计在鱼类中枢神经非造血细胞(non-haematopoieticcells)的听侧腺系统(acoustico-lateralissystem)的发生过程中起作用。从斑点叉尾鮰鉴定出CXCL14样趋化因子,与哺乳动物CXCL14有高度同源性,可以建立明确的直向同源关系。1.3cc趋化因子亚族CC趋化因子之所以这样命名,是因为它的前两个保守半胱氨酸残基的排列。这类趋化因子是单核细胞的趋化现象的中间者(与CXC是嗜中性粒细胞的中间者相对照)。共发现了哺乳动物的28个CC趋化因子(CCL1-CCL28)。然而,从同一种动物鉴定出的最大数目趋化因子数目却较小。在28个趋化因子中,CCL6,CCL9/CCL10,和CCL12还没有在人类中发现,也就是说,人类中共发现25个趋化因子。在鼠中,CCL3L1、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL18、CCL23和CCL26尚未发现,即鼠类动物中只发现了21个趋化因子。因而,在一种生物发现最多的是人类,25个趋化因子。根据功能和结构特点,哺乳动物CC趋化因子亚族又分为几个亚组。第一个是致敏性亚组CC趋化因子,是单细胞趋化性蛋白(MCPs),包括CCL1、CCL2、CCL7、CCL8和CCL11,鼠类CCL12、CCL13、CCL24和CCL26,一般来说都是嗜曙红细胞和嗜碱性细胞的有效的引诱剂,能够释放组胺。致敏性趋化因子在感染条件下表现出可诱导性表达。第二亚组是前炎症趋化因子,包括CCL3、CCL4(两个都是巨噬细胞感染蛋白)、CCL5、CCL6和CCL18。此亚组趋化因子也表现为感染条件下的诱导表达,吸引单核细胞、T淋巴细胞和嗜曙红细胞。第三亚组是滤血趋化因子亚组(HCC,haemofiltrateCCchemokines),包括CCL14、CCL15、CCL16和CCL23。这些趋化因子在炎症反应过程中也起到重要作用,不表现为感染后的诱导表达。第四个亚组是所谓的发育亚组,包括CCL17、CCL22、CCL25。CCL17和CCL22具有相同功能,能够趋化起源于单细胞的树枝状细胞和被IL-2激活的NK细胞,CCL25能够趋化单核细胞、肾树突细胞、胸腺细胞,并且在淋巴循环中起作用。第五个亚组是属于自我平衡的(homeostatic)CC趋化因子,包括CCL19、CCL20和CCL21。它们由淋巴组织持续表达,并指引T细胞和成熟的树突细胞(dentriticcells)向淋巴组织内特定区域运动。1.4cc趋化因子CC趋化因子鉴定工作进展一直较慢,一个原因就是CC趋化因子多变性,另一个原因就是大部分CC趋化因子的分子量较小,一般约为100个氨基酸。结果基于使用不同种类的核酸序列所设计的探针或引物所进行的杂交或PCR方法的分子克隆,不是十分有效。同理,低序列保守性阻碍了用生物信息学方法进行DNA核苷酸水平上的序列分析。尽管如此,一些重要基因的发现已经帮助我们对鱼类CC趋化因子的研究。虹鳟CK1基因是第一个被描述的鱼类CC趋化因子,有6个半胱氨酸残基,与哺乳动物的CCL20高度相似。第二个CC趋化因子I是从鲤(Cyprinuscarpio)中分离来的,它与哺乳动物致敏性(MCP)亚组高度相似。第三个CC趋化因子CK2是从虹鳟鱼鉴定出来的。这些早期的工作提供了第一个启示,建立与哺乳动物直向同源相似性是困难的,所有这些蛋白质氨基酸序列与任何相近的哺乳动物对应蛋白质同源性水平都不超过40%。早期鱼类CC趋化因子发现的缺乏致使人们猜测鱼类与现存的哺乳动物在趋化因子方面有很少的直向同源性。由于存在这一认识,人们期望在现有的种类中,只能有少量的CC趋化因子能够鉴定出来。哺乳动物CC趋化因子的大多数在进化谱中都表现出唯一性。因此,近期使用基因组学方法使得鱼类趋化因子得以快速的发现,对于一些人来讲是一个惊讶。7个新的趋化因子来自两个丽鱼科(Paralabidochromischilotes和Melanochromisauratu)。而猫鲛鱼(Scyliorhinuscanicula)是两年前报道的,接下来就是14个CC趋化因子来自斑点叉尾鮰和蓝鮰,15个CC趋化因子来自虹鳟鱼。后两组CC趋化因子的鉴定对以往鱼类免疫系统的观念提出了新的挑战,这两组CC趋化因子在公共数据库中将作为未来功能分析的基础,同时,也对其它种类的研究起到一个信息叠加积累作用。2命名中的错误和不对称趋化因子基因构成一个家族,根据其氨基酸序列结构基序的不同,这个家族可以分为几个亚家族。趋化因子的共同性质是白细胞趋化性。像Bacon等(2003)所归纳的,以往的趋化因子是随机命名,因而,缺乏命名的系统性。一些趋化因子被称为白细胞介素类(如IL-8),而另一些则冠以说明功能的名称(如巨噬细胞趋化蛋白),还有一些根据产生这些趋化因子的细胞类型来命名(如血小板因子4)。一般来说,所选择的名称都比较混乱,不便于使用,致使这些趋化因子几乎总是以名字的缩写形式被引用(如PANTES)。很多趋化因子表现出重叠功能,在鉴别与特定试验观察资料相关的趋化因子时易引起混淆。为了避免趋化因子命名的混乱,国际免疫学会(IUIS)和世界卫生组织趋化因子命名组委会(WHOSubcommitteeonChemokineNomenclature)采用了趋化因子的标准命名法。在这个新的命名系统中,趋化因子分为CXC、CC、C和CX3C4个亚组,名字分别是在其亚组名后,加上一个字母“L”表示配体(Ligand)和一个阿拉伯数字,如CXCL5。鱼类趋化因子的命名也同样混乱和混淆。一些报道使用了哺乳动物趋化因子旧的传统命名法,而不是新的标准命名系统。例如,类白细胞介素8(IL-8like)在牙鲆、虹鳟鱼、七鳃鳗和斑点叉尾鮰中都有描述。其它一些报道,虽然使用了标准命名系统,却没有给出有力的系统发生的支持和进行功能分析,基因鉴定纯粹是基于序列同源相似性比对。这种基于同哺乳动物趋化因子进行序列同源性比对以后给出的趋化因子名称可能是真实的,但是还缺乏系统进化上的证据支持,也缺乏实验数据对其功能进行验证。在虹鳟鱼,CC趋化因子使用CKx系统来命名,X表示基因鉴定的时间,但是不反映与哺乳动物直向同源关系。Kuroda等(2003)使用SCY-A、B、C、D系统分别表示CC、CXC、CX3C和C4种类型趋化因子基因,用起始于101的三位阿拉伯数字表示此趋化因子基因来自鱼类,也表示这些趋化因子发现的时间。这个系统也被He等(2004)用来描述鮰鱼的趋化因子基因